基于Au纳米粒子修饰MXene递药系统的构建及其抗乳腺癌研究

Construction of MXene Delivery System Modified by Au Nanoparticles and Its Anti-Breast Cancer Effect

摘要: 目的：近年来，MXene作为一种新型二维(2D)纳米材料，因其优异的性能而被广泛研究用作纳米递药平台。为了探索其新的表面改性方式和抗乳腺癌作用，我们构建了DOX@Ti3C2@Au-PEG纳米复合药物递送系统。方法：采用金纳米颗粒(Au NPs)对Ti3C2进行改性，引入巯基聚乙二醇醛基(SH-PEG-CHO)提高水溶性，同时负载化疗药物阿霉素(DOX)，制备DOX@Ti3C2@Au-PEG纳米复合药物递送系统，进行表征验证其成功制备，并进一步研究其光热性能和抗乳腺癌作用。结果：Ti3C2被成功刻蚀成单层薄片，Au NPs在其表面均匀散在分布，平均尺寸约为20 nm。Ti3C2@Au纳米复合材料具有良好的光热升温性能和极低的细胞毒性。细胞试验证明，DOX@Ti3C2@Au-PEG纳米复合体系取得了最佳的光热治疗(PTT)协同化疗的抗乳腺癌效果。结论：成功构建基于Au纳米粒子修饰MXene的药物递送体系DOX@Ti3C2@Au-PEG，其展现出良好的光热升温性能及协同化疗的抗乳腺癌效果，值得进一步研究。

Abstract: Objective: In recent years, MXene, as a new two-dimensional (2D) nanomaterial, has been widely studied as a nanodrug delivery platform due to its excellent properties. In order to explore the new surface modification method and anti-breast cancer effect, we constructed DOX@Ti3C2@Au-PEG nanocomposite drug delivery system. Methods: Ti3C2 was modified by gold nanoparticles (Au NPs), the sulfhydryl polyethylene glycol aldehyde group (SH-PEG-CHO) was introduced to improve water solubility, and chemotherapy drug DOX was loaded at the same time to construct the DOX@Ti3C2@Au-PEG nanocomposite drug delivery system, and its successful preparation was verified by characterization. Further experiments were conducted to study its photothermal properties and anti-breast cancer effects. Results: Ti3C2 was successfully etched into a single layer. Au NPs were evenly distributed on the surface with an average size of about 20 nm. Ti3C2@Au nanocomposites have good photothermal heating performance and low cytotoxicity. Cell experi-ments have proved that DOX@Ti3C2@Au-PEG nanocomposite system has achieved the best an-ti-breast cancer effect of photothermal therapy (PTT) combined with chemotherapy. Conclusion: The drug delivery system DOX@Ti3C2@Au-PEG based on Au nanoparticles modified MXene was successfully constructed, which showed excellent anti-breast cancer treatment effect of photothermal chemotherapy, which deserves further study.

1. 引言

近年来，乳腺癌的发病率逐渐上升 [1]，其治疗仍主要采用手术、化疗、放疗等传统手段。然而这些传统的治疗方法虽然能取得良好的治疗效果，但也存在许多不可避免的缺点，如选择性差、全身毒性高、易产生耐药性、容易复发和转移等 [2]。因此，探索新的肿瘤治疗方法，采用协同治疗是未来肿瘤治疗的新方向。光热治疗(PTT)是一种在肿瘤组织中聚集光热转化剂的新型治疗方法，光热转化剂在外部光源的照射下，吸收光能，产生能量转换，将光能转化成热能，使其局部温度升高，从而杀死癌细胞或组织 [3]。PTT作为一种无创治疗方法，因其毒性低、副作用少而受到越来越多学者的关注。

目前，二维(2D)纳米材料，包括石墨烯 [4]、锑烯 [5]、黑鳞 [6]、二卤代物和氧化物 [7]。因其具有超薄的片层结构、丰富的表面功能、较大的比表面积和较低的生物毒性，在生物医学领域得到广泛研究。除上述材料外，MXene作为一种新型的2D纳米材料，也引起了科学界的广泛兴趣 [8] [9]。对于公式为M_n+1X_nT_x (n = 1~3)的材料，通常由过渡金属(M)和碳/氮(X)组成，并由它们所对应的MAX相生成。A代表元素周期表中IIIA或者IVA族的元素，T_x代表它们的表面官能团，如-O、-OH、和-F，这取决于所选用的刻蚀剂。与传统的2D纳米材料相比，MXene在生物医学应用中具有以下几个优点：1) 丰富的表面官能团使其具有良好的亲水性，解决了大多数化疗药物疏水性的缺点 [10]；2) 具有极低的细胞毒性和良好的生物组织相容性 [11] [12]；3) 巨大的活性表面，可连载化疗药物进行协同化疗，或与靶向分子连接进行靶向治疗 [13]；4) 具有较高的近红外光吸收性能和光热转化效率 [14]。这些特性使得MXene不仅是一种良好的光热转化剂，同时也是一种理想的抗癌药物传递载体，以配合化疗达到更好的治疗效果。

在本研究中，通过原位生长的方法将Au NPs固定在Ti₃C₂表面，引入巯基聚乙二醇醛基(SH-PEG-CHO)增加载体水溶性，同时负载化疗药物阿霉素(DOX)，构建DOX@Ti₃C₂@Au-PEG纳米复合体系，探究其体内外光热转化性能和抗乳腺癌作用，为肿瘤治疗提供新的研究思路。

2. 实验部分

2.1. 实验材料

盐酸，氟化锂，氯金酸，国药集团化学试剂有限公司；巯基聚乙二醇醛基(SH-PEG-CHO，分子量5000)，西安齐岳生物有限公司；四羟甲基氯化磷(THPC, 80%)，聚丙烯胺盐酸盐(PAH，分子量15,000)，上海阿拉丁生化科技有限公司；阿霉素(DOX)，大连美仑生物科技有限公司；CCK-8试剂盒，MedChemExpress；RPMI-1640培养基，胎牛血清(FBS)，美国GIBCO公司。

2.2. DOX@Ti₃C₂@Au-PEG纳米复合递药体系的制备

首先，用盐酸/氟化锂刻蚀掉最大相Ti₃AlC₂中的Al层，合成Ti₃C₂纳米薄片。将1 g氟化锂加入到20 mL 9 M盐酸溶液中搅拌5 min使氟化锂完全溶解，然后将1 g Ti₃AlC₂逐渐加入上述溶液，35℃环境中反应24 h。多次离心、洗涤至上清液pH达到6时，得到Ti₃C₂纳米薄片。

然后，制备金种子和金生长溶液，并采用原位生长的方法将Au NPs固定在Ti₃C₂纳米片表面。将12 µL四羟甲基氯化磷(THPC, 80%)和0.25 mL氢氧化钠(2 M)溶液加入到45 mL超纯水中搅拌5 min，将2 mL氯金酸溶液(1%)快速加入上述溶液中，室温下避光搅拌过夜，得到金种子溶液。将25 mg碳酸钾加入到含有1.5 mL氯金酸的100 mL超纯水中，室温下避光搅拌过夜，得到金生长溶液。将2 mL Ti₃C₂纳米片悬液(1 mg∙mL⁻¹)加入到4 mL 2 mg∙mL⁻¹的聚丙烯胺盐酸盐(PAH，分子量15,000)溶液中充分反应，离心洗涤去除多余PAH分子后，加入10 mL金种子溶液，室温搅拌4 h，离心洗涤去除多余金种子溶液后，加入金生长溶液搅拌2 h，加入29%甲醛溶液搅拌1 h，即得到含Ti₃C₂@Au的悬液。

最终，制备DOX@Ti₃C₂@Au-PEG纳米复合递药体系。将1 mL Ti₃C₂@Au (1 mg∙mL⁻¹)悬液分散在4 mL巯基聚乙二醇醛基(SH-PEG-CHO, 4 mg∙mL⁻¹)溶液中搅拌2 h，加入20 mL 10 µg∙mL⁻¹ DOX溶液，室温下避光搅拌过夜，将沉淀物收集为DOX@Ti₃C₂@Au-PEG，冷冻干燥后，置于−20℃储存以备后续使用。

2.3. 表征

使用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察Ti₃C₂纳米片和Ti₃C₂@Au纳米复合材料的形貌，使用红外热成像仪记录实验中的温度变化。

2.4. 体外光热转化性能研究

将Ti₃C₂@Au悬液(0.05 mg∙mL⁻¹)用808 nm、0.75 W cm^-2的激光照射10 min，观察其温度变化情况，并与水溶液作对照。Ti₃C₂@Au悬液(0.1 mg∙mL⁻¹)分别经808 nm、不同功率(0.25、0.5、0.75、1 W∙cm⁻²)激光照射5 min，研究其光热升温性能。

2.5. 细胞实验

2.5.1. 细胞培养

小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞由青岛大学附属医院中心实验室提供。使用含有90% RPMI-1640基础培养基、10% FBS和1%青霉素/链霉素双抗溶液的完全培养基进行培养，置于37℃、含5% CO₂的细胞培养箱中孵育。

2.5.2. 体外DOX@Ti₃C₂@Au-PEG抗乳腺癌研究

为研究Ti₃C₂@Au-PEG纳米复合载体的细胞毒性，首先将4T1细胞以8 × 10³/孔的密度接种于96孔板中，完全培养基孵育过夜，使细胞贴壁，加入不同浓度的Ti₃C₂@Au-PEG悬液(0、150、300、450、600 ppm)孵育24 h，每个浓度设五个复孔，孵育结束后，使用CCK-8试剂盒检测细胞相对存活率。为研究不同浓度Ti₃C₂@Au-PEG悬液经NIR照射的细胞杀伤作用，将同样孵育过夜的贴壁细胞，分别与不同浓度Ti₃C₂@Au-PEG悬液(0、25、50、75、100 ppm)孵育4 h，用808 nm、0.75 W∙cm⁻²的激光照射5 min，使用CCK-8试剂盒检测细胞相对存活率。

将4T1细胞以8 × 10³/孔的密度接种于96孔板中，完全培养基孵育过夜，使细胞贴壁。如表1所示，分五组进行实验，各组处理结束后，使用Calcein/PI双染试剂盒进行细胞染色，活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色。每组设五个复孔，重复三次实验。

Table 1. Cell experiment groups

表1. 细胞实验分组

2.6. 统计学分析

使用SPSS26.0软件进行统计学分析。定量资料以均数 ± 标准差(Means ± SD)表示，两组间均数数比较采用两独立样本t检验(independent samples t-test)，P < 0.05认为差异具有统计学意义。

3. 结果与讨论

3.1. 基于Au NPs修饰Ti₃C₂的纳米复合载体的表征

为了证实单层Ti₃C₂和Ti₃C₂@Au纳米复合材料的成功制备，对其进行了SEM表征，如图1(a)、图1(b)所示，合成的Ti₃C₂表面干净，略有卷曲，Au NPs均匀地散在分布在Ti₃C₂纳米片表面，出现几条褶皱，说明其具有良好的柔韧性，SEM图像直接证实了Ti₃C₂和Ti₃C₂@Au的成功制备。

TEM图像(图2(a)，图2(b))所得结果与SEM图像相对应，可以更加清晰地看到Ti₃C₂纳米片的形貌，已经被完全刻蚀呈薄层状，另外，Au NPs在其表面的均匀分布，粒径在5~30 nm之间，这样相对较小的纳米粒径，为后续体内有效循环提供了可能性。

另外，Ti₃C₂@Au纳米复合材料的能量色散分析表(表2)显示了其主要元素组成：C (51.62%)、Ti (1.76%)、Au (8.81%)，其中Al层已经从MAX相中被完全刻蚀掉，说明Ti₃C₂的成功制备以及Au NPs的良好表面固定。

(a) (b)

Figure 1. The SEM images of Ti₃C₂ (a) and Ti₃C₂@Au (b)

图1. Ti₃C₂ (a) 和Ti₃C₂@Au (b) 的扫描电子显微镜(SEM)图像

(a) (b)

Figure 2. The TEM images of Ti₃C₂ (a) and Ti₃C₂@Au (b)

图2. Ti₃C₂ (a) 和Ti₃C₂@Au (b) 的透射电子显微镜(TEM)图像

Table 2. Main element composition of Ti3C2@Au nanocomposites

表2. Ti₃C₂@Au纳米复合材料的主要元素组成

3.2. 体外光热转化性能研究

用808 nm、0.75 W∙cm⁻²的激光照射Ti₃C₂@Au悬液(0.05 mg∙mL⁻¹) 10 min，其温度可以达到49.4℃，而相同条件下，水溶液仅能达到36.5℃(图3(a))，二者之间存在显著统计学差异(P < 0.01)。Au NP作为一种贵金属，本身具有很好的光热升温性能，与纳米材料结合在一起，进一步提高了整个载体的光热转化效率。另外，用808 nm、不同功率(0.25、0.5、0.75、1 W∙cm⁻²)的NIR照射Ti₃C₂@Au悬液(0.1 mg∙mL⁻¹) 5 min，结果如图3(b)所示，随着功率的增加，Ti₃C₂@Au悬液的温度逐渐升高，且各组间存在显著统计学差异。当功率为1 W∙cm⁻²时，最高可以达到56℃，较初始温度升高了26.3℃，说明其具有优异的体外光热升温性能。

注：*：各组间相比，P < 0.05；**：两组间相比，P < 0.01；***：与其余三组相比，P < 0.001。

Figure 3. (a) Heating effect of H₂O and Ti₃C₂@Au suspension (0.05 mg∙mL⁻¹) irradiated by NIR (808 nm, 0.75 W∙cm⁻²) for 10 min. (b) Heating effect of Ti₃C₂@Au suspension (0.1 mg∙mL⁻¹) irradiated by NIR (808 nm) with different powers (0.25, 0.5, 0.75, 1 W∙cm⁻²) for 5 min

图3. (a) H₂O和Ti₃C₂@Au悬液(0.05 mg∙mL⁻¹)用808 nm、0.75 W∙cm⁻²的激光照射10 min的升温效应。(b) Ti₃C₂@Au悬液(0.1 mg∙mL⁻¹)经808 nm、不同功率(0.25、0.5、0.75、1 W∙cm⁻²)的NIR照射5 min的升温效应

注：(1) 对照组；(2) NIR组；(3) DOX组；(4) DOX@Ti₃C₂@Au组；(5) DOX@Ti₃C₂@Au + NIR组。ns：无统计学差异；*：与对照组相比，P < 0.05；**：与对照组相比，P < 0.01；***：与对照组相比，P < 0.001。

Figure 4. (a) The cell survival rate after coincubation with different concentrations Ti₃C₂@Au suspensions (0, 150, 300, 450, 600 ppm) for 24 h. (b) The cell survival rate of each group

图4. (a) 4T1细胞与不同浓度Ti₃C₂@Au-PEG悬液(0、150、300、450、600 ppm)共孵育24 h后的细胞存活率。(b) 各处理组的细胞存活率

3.3. 细胞实验

考虑到纳米复合载体在生物医学领域的实际应用，其细胞毒性成为一个关键性问题。CCK-8试验显示(图4(a))，即使Ti₃C₂@Au-PEG纳米复合载体的浓度达到600 ppm时，细胞仍保持较高的存活率(平均值为96.1%)，且在各浓度下，其细胞存活率与对照组相比，无统计学差异(P > 0.05)，这表明Ti₃C₂@Au-PEG纳米复合载体无明显细胞毒性，这为进一步体内研究和将来的临床应用转化提供了可能性。此外，按表1所示分组给予4T1细胞相应处理后，进行CCK-8试验，结果如图4(b)所示，各组细胞存活率与对照组相比，均存在统计学差异，这说明各疗法均可取得一定疗效，但DOX@Ti₃C₂@Au + NIR组治疗效果最明显，其细胞存活率仅为17.8%，且与对照组之间存在显著统计学差异(P < 0.001)，这说明PTT联合化疗的综合抗乳腺癌效果最佳，有望取代单一疗法成为更好的治疗策略。此外，光热效应不仅本身可以通过高热导致肿瘤细胞死亡，而且可能有效增加细胞通透性，从而加强细胞对药物和载体的摄取，进一步导致肿瘤细胞死亡。

4. 结论

综上所述，本研究成功制备了基于Au NPs修饰MXene的纳米复合递药体系DOX@Ti₃C₂@Au-PEG，Ti₃C₂@Au-PEG纳米载体具有良好的光热升温性能，表现出极低的细胞毒性，巨大的表面有利于药物负载，可以用作稳定的肿瘤协同治疗的递药载体。该纳米复合递药体系，在细胞实验中初步展现出良好的PTT协同化疗的综合抗乳腺癌效果，说明联合疗法优于各单一疗法，这表明MXene在纳米递药生物医学领域具有广阔的应用前景，值得进行下一步探索。

基金项目

山东省自然科学基金资助项目(ZR2017MH042)。

致谢

刘爱萍负责设计实验、进行实验、数据整理分析和文章撰写，刘耿君和李雅欣参与部分细胞实验，王海燕负责课题总体构思和修改文章。

NOTES

^*通讯作者，Email: [e-mail]。