摘要: 目的：探讨免疫性血小板减少症(ITP)患儿血清miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p的表达水平及其临床意义。方法：收集2019年8月~2021年8月青岛大学附属医院收治的96例ITP患儿作为ITP组，另在本院体检中心收集100例性别、年龄相匹配的健康儿童作为对照组。所有患儿行常规血小板检查，采用逆转录–聚合酶链式反应(RT-PCR)检测外周血miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p表达水平。比较miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p单独检测与联合检测对ITP的诊断价值。结果：与对照组比较，ITP组患儿PLT、PCT水平显著降低，MPV、PDW水平显著增加，差异具有统计学意义(P < 0.05)。RT-PCR结果显示，与对照组比较，ITP组患儿外周血miR-320c和miR-4739表达显著增加，miR-3162-3p表达显著降低，差异具有统计学意义(P < 0.05)。绘制ROC曲线结果显示，miR-320c单独检测诊断ITP的曲线下面积(AUC)为0.782，95%CI为0.733~0.831；miR-4739单独检测诊断ITP的AUC为0.774，95%CI为0.678~0.799；miR-3162-3p单独检测诊断ITP的AUC为0.739，95%CI为0.723~0.826；三者联合诊断的AUC为0.844，95%CI为0.813~0.875；联合诊断AUC大于单独诊断，差异具有统计学意义(P < 0.05)。结论：ITP患儿外周血血清miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p表达异常，其表达水平可用于检测ITP，且三者联合检测，诊断价值更高，可作为早期诊断儿童ITP的生物标志物。
Abstract:
Objective: To investigate the expression and clinical significance of miR-320c, miR-4739 and miR-3162-3p in serum of children with immune thrombocytopenia (ITP). Methods: A total of 96 ITP children admitted to the Affiliated Hospital of Qingdao University from August 2019 to August 2021 were selected as the ITP group. Another 100 healthy children with matched sex and age were collected as control group in the physical examination center of our hospital. All children underwent routine platelet examination. The expression levels of miR-320c, miR-4739 and miR-3162-3p in peripheral blood were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The diagnostic value of miR-320c, miR-4739 and miR-3162-3p individual and combined detection for ITP was compared. Results: Compared with the control group, the levels of PLT and PCT in ITP group were significantly decreased, while the levels of MPV and PDW were significantly increased, with statistical significance (P < 0.05). RT-PCR results showed that compared with the control group, the expressions of miR-320c and miR-4739 in the peripheral blood of children in the ITP group were significantly increased, and the expression of miR-3162-3p was significantly decreased, with statistical significance (P < 0.05). The ROC curve results showed that the area under the curve (AUC) of miR-320c alone for detecting and diagnosing ITP was 0.782, and 95%CI was 0.733~0.831. The AUC of miR-4739 alone in detecting and diagnosing ITP was 0.774 and 95%CI was 0.678~0.799. The AUC of miR-3162-3p alone was 0.739 and 95%CI was 0.723~0.826 for ITP detection. The AUC and 95%CI of combined diagnosis were 0.844 and 0.813~0.875 respectively. The AUC of combined diagnosis was greater than that of single diagnosis, and the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusions: The abnormal expressions of miR-320c, miR-4739 and miR-3162-3p in the peripheral blood serum of children with ITP can be used to detect ITP. Moreover, the combined detection of the three has higher diagnostic value and can be used as a biomarker for early diagnosis of ITP in children.
1. 引言
免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia, ITP)是一种免疫介导的血小板减少综合征，是临床最常见的出血性疾病 [1] [2]，多发于2~5岁儿童，临床表现为皮肤紫癜、瘀斑、局部皮肤或口腔、鼻腔黏膜自发性出血，血常规检查显示血小板减少，骨髓涂片可见骨髓巨核细胞成熟障碍 [3] [4]。目前临床多采用免疫抑制剂、糖皮质激素、丙种球蛋白、重组人血小板生成素等治疗ITP。MicroRNA (miRNA)是一类长度在22个碱基左右的内源性非编码RNA分子，调节20%~80%的宿主基因，可通过结合mRNA的3'-UTR来调节基因转录后表达 [5] [6] [7]。大量研究证明不同miRNA的表达与自身免疫性疾病的发生发展相关 [8] [9] [10] [11]。Zuo等人发现，miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p在健康人群和ITP患者血液中的表达有显著差异 [12]。文献研究发现，miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p和多种免疫疾病相关 [13] - [19]。本研究旨在评估miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p在ITP患儿中的表达及其临床意义，为儿童ITP的诊断和治疗提供新的靶点和更多的理论依据。
2. 材料和方法
2.1. 研究对象
回顾性分析2019年8月~2021年8月青岛大学附属医院收治的96例ITP患儿的临床资料。纳入标准：1) 符合《血液病诊断及疗效标准》中关于ITP的诊断标准 [20]；2) 首次确诊为ITP，首次入院治疗；3) 临床资料完整；4) 患儿及其家属知晓本研究内容，并签署知情同意书。排除标准：1) 合并身体重要器官(心、肝、肺等)功能不全者；2) 合并免疫功能障碍者；3) 合并精神、智力障碍者；4) 合并其他血液疾病；5) 过敏体质者；6) 接受过药物治疗者；7) 其他原因(药物、家族遗传、继发性)导致血小板减少者。96例ITP患儿中，男55例，女41例，年龄2~8岁，平均年龄(3.81 ± 1.31)岁，病程1~6个月，平均病程(3.23 ± 1.30)个月，伴有皮肤瘀斑者28例，鼻腔出血16例，牙龈出血30例，口腔黏膜出血22例。另在本院体检中心收集100例性别、年龄相匹配的健康儿童作为对照组，其中男50例，女50例，年龄2~8岁，平均年龄(3.50 + 1.27)岁。本研究经青岛大学附属医院医学伦理委员会批准。
2.2. 试剂与仪器
BC-5200自动型血球分析仪购自日本东亚公司，高速离心机购自中国赛默飞世尔科技有限公司；RNA抽提试剂盒购自购自美国Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒购自日本Takara公司；RT-PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；miR-320c、miR-4739、miR-3162-3p和U6引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。
2.3. 方法
2.3.1. 血小板相关指标检查
抽取两组受试者空腹外周静脉血6 ml，置于EDTA真空采血管中，采用BC-5200自动型血球分析仪检测血小板四项：血小板计数(platelet, PLT)、血小板平均体积(mean platelet volume, MPV)、血小板压积(plateletcrit, PCT)和血小板分布宽度(platelet distribution width, PDW)。
2.3.2. PT-PCR检测外周血miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p的表达
抽取三组受试者空腹静脉血6 ml，置于EDTA真空采血管中，60 min内进行离心(3000 r/min, 10 min)，取上层血清于−80℃冰箱冷冻，等待检测。采用Trizol法严格按照RNA抽提试剂盒操作说明提取血清总RNA，根据反转录试剂盒操作说明，取1 mg总RNA反转录为cDNA，置于−20℃冰箱冷冻保存待用。采用RT-PCR试剂盒检测患儿血清中miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p的相对表达水平，RT-PCR反应体系为20 μl，包括模板2 μl，上下游引物各1 μl，SYBR Green Premix10μl，双蒸水7 μl。RT-PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，62℃退火60s，72℃延伸12s，共35个循环。本研究选择U6作为内参，引物及内参序列见表1。2-ΔΔCt计算miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p相对表达量。
2.4. 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数数据以n (%)表示，组间比较采用c2检验，计量数据符合正态分布以(
)表示，两组间比较使用独立样本的t检验。采用ROC曲线分析miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p对ITP的诊断价值，P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 比较两组儿童血小板参数值
结果显示，相较于对照组健康儿童，ITP组患儿PLT、PCT水平显著降低，MPV、PDW水平显著增加，差异具有统计学意义(P < 0.05)。见表2。
Table 2. Comparison of platelet parameter values in two groups of children
表2. 两组儿童血小板参数值比较
3.2. 两组儿童血清miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p表达比较
RT-PCR结果显示，与对照组比较，ITP组患儿外周血miR-320c和miR-4739表达显著增加，miR-3162-3p表达显著降低，差异具有统计学意义(P < 0.05)。见图1。
注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 1. Comparison of serum levels of miR-320c, miR-4739 and miR-3162-3p in two groups of children
图1. 两组儿童血清miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p水平比较
3.3. 血清miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p单独或联合检测ITP的诊断价值
ROC曲线显示，miR-320c单独检测诊断ITP的曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.782，95%CI为0.733~0.831，敏感性，特异性分别76.8%，70.8%；miR-4739单独检测诊断ITP的AUC为0.774，95%CI为0.678~0.799，敏感性，特异性分别75.6%，75.3%；miR-3162-3p单独检测诊断ITP的AUC为0.739，95%CI为0.723~0.826，敏感性，特异性分别73.2%，68.6%；三者联合诊断的AUC为0.844，95%CI为0.813~0.875，敏感性，特异性和分别88.4%，80.8%；差异具有统计学意义(P < 0.05)。见图2。
Figure 2. ROC curves of miR-320c, miR-4739 and miR-3162-3p alone or in combination to diagnose ITP
图2. miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p单独或联合检测诊断ITP的ROC曲线图
4. 讨论
ITP是临床常见的出血性疾病，目前尚无法根治。其发病机制目前也尚未明确，以往研究表明，ITP可能主要与自身免疫相关 [21]。ITP在多发病于儿童时期，临床典型表现为血小板减少、骨髓增生活跃、巨噬细胞增多等 [22] [23]。但儿科检查中，由于骨髓穿刺术操作前家长顾虑较多或操作时小儿不配合未能很好施行，因此寻找新的诊断标志物在ITP患儿中尤为重要。miRNA是调节机体细胞增殖、发育、代谢等一系列生理活动的关键分子，在免疫系统稳态的维持中发挥重要作用 [24]。研究发现，在多种自身免疫性疾病中，miRNA表达异常，miRNA的差异表达与免疫疾病的发病机制密切相关。
miR-320c在一种新发现的与血液疾病相关的miRNA，Dahiya等人研究发现，在支气管哮喘患者中，miR-320c表达水平与IL-4水平呈显著正相关 [13]。体外实验发现，miR-320c处理后，血小板活化降低 [14]。李方林研究发现 [25]，miR-320c在急性白血病患者中表达降低，且miR-320c表达水平可用于评估疾病状态。miR-4739与淋巴瘤、病毒性肝炎、胸膜纤维化、糖尿病等相关。王晨等人 [26] 通过高通量miRNA芯片技术分析发现，在ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤中，miR-4739表达降低，检测miR-4739有助于鉴别诊断ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤与CD30阳性非特殊型外周T细胞淋巴瘤。miR-4739在II型糖尿病患者尿外泌体中表达升高，是糖尿病合并严重肢体缺血的生物标志物 [15]。另外，临床研究发现，miR-4739高表达和与胸膜纤维化相关，动物实验表明，抑制miR-4739表达可缓解小鼠胸膜纤维化 [16]。陈玙等人研究发现 [27]，在原发免疫性血小板减少症患者中，β-catenin表达明显升高，miR-3162-3p靶向调节β-catenin。在哮喘患儿中，miR-3162-3p表达水平增强，动物实验发现，抑制miR-3162-3p表达有抗炎功效 [17] [18]。血浆miR-3162-3p水平还可用于HIV新感染鉴定，miR-3162-3p水平随着体外感染时间的延长而降低 [19]。Zuo等人发现，miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p在健康人群和ITP患者血液中的表达有显著差异 [12]。本研究中，我们旨在探讨miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p在ITP患儿中的表达及其临床意义，结果显示，与对照组比较，ITP组患儿外周血miR-320c和miR-4739表达显著增加，miR-3162-3p表达显著降低，差异具有统计学意义(P < 0.05)，与文献研究结果一致。
寻找有效的非侵入性生物标志物对ITP患儿的检测具有重要意义。本研究中，我们分析了miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p单独检测与联合检测对ITP的诊断价值。绘制ROC曲线结果显示，miR-320c单独检测诊断ITP的曲线下面积(AUC)为0.782，95%CI为0.733~0.831；miR-4739单独检测诊断ITP的AUC为0.774，95%CI为0.678~0.799；miR-3162-3p单独检测诊断ITP的AUC为0.739，95%CI为0.723~0.826；三者联合诊断的AUC为0.844，95%CI为0.813~0.875；联合诊断AUC大于单独诊断，差异具有统计学意义(P < 0.05)。说明联合诊断的诊断价值更高。本研究结果提示，在ITP患儿临床诊断中，可通过联合检测miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p的血清表达水平为其诊断提供依据。
5. 结论
综上所述，ITP患儿外周血miR-320c和miR-4739表达增加，miR-3162-3p表达降低，三者联合检测能够提高ITP的诊断效能，可以用作诊断和评估ITP的生物学标记。但是，我们未能解释ITP中miR-320c、miR-4739和miR-3162-3p的机制，这需要通过体内和体外实验进一步阐明。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。