基于肝星状细胞的肝纤维化治疗机制研究概述

Overview of the Therapeutic Mechanism of Liver Fibrosis Based on Hepatic Stellate Cells

摘要: 肝纤维化是一个动态的肝脏疤痕修复过程，其特征是细胞外基质的净积累，是各种慢性肝病进展的共同转归。到目前为止，对于抗纤维化的治疗尚无有效的方法，除肝移植外。活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSCs)在肝纤维化的起始和进展中发挥着重要核心作用。造血干细胞和那些“反应”细胞之间的细胞间交流是造血干细胞激活和纤维形成的关键事件，miRNA、circRNA和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)与HSCs的活化有着密不可分的关系。本文概述了肝纤维化发生发展过程中与肝星状细胞相关的几种常见机制，描述了造血干细胞与其他“反应”细胞之间的细胞间通讯及在造血干细胞活化过程中的作用，为潜在的抗纤维化治疗策略提供了新的思路。

Abstract: Hepatic fibrosis is a dynamic liver scar repair process characterized by net accumulation of extra-cellular matrix and is a common outcome of the progression of various chronic liver diseases. So far, there is no effective treatment for anti-fibrosis, except liver transplantation. Activated hepatic stel-late cells (HSCs) are the main cell source of stromal myofibroblasts, and play an important role in the initiation and progression of hepatic fibrosis. Intercellular communication between hematopoi-etic stem cells and those “reactive” cells is the key event of hematopoietic stem cell activation and fiber formation. MiRNA, circRNA and all-trans retinoic acid (ATRA) are closely related to activation of HSCs. In this paper, several common mechanisms related to hepatic stellate cells during the de-velopment and progression of hepatic fibrosis are summarized, and the intercellular communica-tion between hematopoietic stem cells and other “reactive” cells and their roles in the activation of hematopoietic stem cells are described, providing new ideas for potential anti-fibrosis treatment strategies.

1. 引言

肝纤维化是一种由多种慢性肝损伤引起的异常创面修复反应，以弥漫性细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积和结缔组织异常增生为特征 [1]。多种慢性刺激可导致肝纤维化，包括慢性病毒感染(乙型或丙型肝炎病毒)、毒性损伤、酗酒(长期过量饮酒)、非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病、代谢性和遗传性疾病 [2]。全球约有2.4亿人是乙型肝炎病毒的携带者，高达40%的感染者会进展为肝硬化、肝细胞癌或慢性肝病末期，肝纤维化成为慢性肝病发展至肝硬化、肝癌的必经病理阶段 [3]。肝纤维化如不及时治疗，可发展为肝硬化，并出现一系列致命的并发症，如功能性肝衰竭、门脉高压、腹水、肝性脑病、肾脏和心脏功能不全，甚至肝细胞癌 [4]。肝硬化是肝癌的一个重要危险因素，是对人类健康的挑战，每年导致全球116万人死亡。虽然有研究表明肝纤维化是可逆的，肝硬化在某些情况下可能会消退，但目前尚无有效的抗纤维化治疗方法 [5]。唯一可用的治疗方法是消除慢性应激和肝移植 [6]。因此，明确肝纤维化发生发展的重要机制，发现更有效的抗纤维化治疗方法，提高肝纤维化患者的生活质量是当务之急。

本文主要概述了近年来几种与肝星状细胞相关的肝纤维化发病机制，描述了造血干细胞与其他“反应细胞”之间及细胞间相互作用在造血干细胞活化过程中的作用。介绍了参与星状细胞激活启动和维持激活的星状细胞的分子同样重要。还概述了miRNA、circRNA及ATRA与肝星状细胞的关系，这提供了对肝纤维化潜在的机制的更深入的理解和有效抗纤维化治疗的新思路。

2. 造血干细胞与HSCs

活化的HSCs是产生基质的肌成纤维细胞的主要细胞来源，在肝纤维化的起始和进展中起着重要作用。位于窦周间隙的非实质细胞是公认的产生基质的肌成纤维细胞的主要细胞来源，其转分化为增生性和成纤维性肌成纤维细胞样细胞的过程被称为“激活” [7]。HSCs的活化是一个动态的过程，主要依赖于与其他“反应”细胞的相互作用，这些“反应”细胞主要由肝细胞、肝窦内皮细胞(LSECs)、肝巨噬细胞、自然杀伤/自然杀伤T细胞(NK/NKT)、胆道上皮细胞(BECs)、肝祖细胞(HPCs)和血小板组成。它们之间可以相互交流 [8]。在这个相互作用的网络中，这些细胞释放的趋化因子和分子信号直接或间接地影响造血干细胞的状态，即“静止”或“激活”的造血干细胞调控肝纤维化的进展、加重和消退。

造血干细胞来源于胚胎间皮细胞，驻留在肝细胞和内皮细胞之间的虚拟亚内皮空间中，小分子或可溶性分子在这里进行双向转移。造血干细胞在正常肝脏中是静止的，占肝细胞总数的5%~8%；在任何原因导致的肝纤维化发生后，静止的造血干细胞会被激活，逐渐减少维生素A的储存能力，增殖，发展收缩功能，分泌过多的ECM蛋白，并释放一系列促炎因子(如：白介素6 [IL-6])和促纤维化因子(如转化生长因子β [TGF-β]) [9]。活化的造血干细胞转分化为肌成纤维细胞样细胞，是肝纤维化中过多的ECM的主要来源，被定义为一系列蛋白质，包括α平滑肌肉肌动蛋白(αSMA)，胶原蛋白(1 a1、3 a1)、波形蛋白、骨桥蛋白、lysyl氧化酶类(LOX)的金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP1) [10]。因此，造血干细胞成为了抗纤维化治疗的主要靶点。

在慢性肝病(Chronic Liver Disease [CLD])期间，造血干细胞可分化为一种激活的肌成纤维细胞样状态(aHSC)，并发挥增殖、收缩、成纤维、趋化和免疫调节表型 [11]。普遍接受的外周细胞样细胞(qHSC)分化为aHSC的模型提出了两个步骤：第一步是启动，包括启动造血干细胞，使其对细胞因子和其他细胞外信号敏感。第二步是延续，涉及到分化到完全激活的表型，包括激活ECM基因表达 [12]。这个模型暗示，一旦CLD患者的肝纤维化形成，潜在的HSC靶向治疗需要关注永久的表型，因为起始阶段已经过去很长时间了。因此，目前抗aHSC的治疗候选者主要针对aHSC的特性，如LOXL2或TIMP1的活性 [13]，这些特性是瘢痕组织成熟所必需的。然而，CLD发病后星状细胞活化起始阶段是否仍然重要尚不清楚，这在寻求新的治疗候选时被忽视。最新有研究表明 [14]，使用转录的方法来研究HSCs激活的所有阶段的转录改变，并提供证据证明在转录水平上起始阶段和永久阶段没有明确的区别。

目前的治疗靶点主要是针对转录水平上抑制或恢复造血干细胞的永久状态(如PPARγ激动剂)或减轻炎症(如CCR2/CCR5拮抗剂)和纤维化(如LOXL2或TIMP1拮抗剂)的造血干细胞表型 [12] [13]。由于在这里展示了与肝星状细胞启动相关的转录程序仍在慢性肝病期间发生，得出结论，启动事件并不仅仅发生在肝脏疾病的发作，值得进一步研究以寻求新的治疗靶点。HSCs在转录水平激活的起始和延续不是顺序的过程，在整个CLD甚至肝硬化期间发生。我们可以认为参与星状细胞激活启动和维持激活的星状细胞的分子同样重要。

3. miRNA与HSCs

MicroRNAs (miRNAs)是一种小型非编码RNA的亚类，约有22个核苷酸，通过抑制靶序列的翻译或稳定性来调节基因表达 [15]。它们可以通过外质体作为货物装载和转移，以调节附近和远处接收细胞的功能。许多微小RNA如miR-21、miR-29、miR-708、miR-101、miR-455、miR-146、miR-193在活化的HSC中的表达发生显著变化，它们通过影响靶基因表达和信号通路分子来调节HSC的活化、纤维化功能、增殖、凋亡和自噬。越来越多的研究表明，某些miRNA参与了肝纤维化的起始和进展。例如，miR-378a-3p被证明可以通过靶向Gli3表达来限制造血干细胞和肝纤维化的激活 [16]。相反，miR-214通过抑制Sufu表达促进HSC活化和肝纤维化 [17]。此外，多种miRNAs (即miR-122、miR-101、miR-133a、miR-221/222、miR-181b和miR-19b)参与控制HSCs激活和肝纤维化 [18]。Yang [19] 通过荧光素酶检测和RT-qPCR，发现miR-199a-3p在造血干细胞中的表达受转录因子Twist1的驱动，TGF-β进一步诱导该转录因子的表达，揭示了miR-199a-3p在促进星状细胞激活中的作用。在机制上，miR-199a-3p通过靶向CAV2负调控I型转化生长因子受体(TGFβ ri)的表达，在TGF-β信号通路激活中发挥重要作用。更重要的是，在体内用antagomiR沉默miR-199a-3p可以减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化，这表明它是一个很有希望的减缓甚至逆转肝纤维化的靶点。

有研究表明，转化生长因子βⅡ型受体(transforming growth factor-beta receptor type 2, TGFβR2)是转化生长因子β受体信号传导中一种细胞膜蛋白，与肝纤维化和肝纤维化条件下肝星状细胞的活化密切相关 [7]。相关研究表明，mi R-373可结合TGFβR2启动子，抑制TGFβR2的启动子活性，miR-373可调控TGFβR2表达，抑制肝星状细胞活化 [20]。miR-373是调控肝星状细胞活化的重要miRNA分子，miR-373调控的转化生长因子β通路可能成为肝纤维化诊断及治疗的新靶点。

4. circRNA与HSCs

近年来研究 [21] 表明，胶原酶活性的增加、活化的肌成纤维细胞的消失、促炎和纤维化细胞因子的抑制导致ECM产生的减少和降解的增加，最终导致肝纤维化的逆转。然而外泌体生物学的新兴领域已经确定了几种新的外泌体细胞间的转移途径，这些途径不仅促进肝纤维化的发展，同样可以帮助缓解纤维化。研究表明 [22]，外泌体中非编码RNA在肝纤维化的发生发展过程中起着重要作用。其主要有外泌体长链非编码RNA (包括MALAT1、H19、GAS5、MEG3、PVT1和P21)、外泌体短链非编码RNA(包括微小RNA、小核仁RNA、PIWI-interacting RNA和小干扰RNA)、外泌体环状RNA (circRNA)，在此，主要描述circRNA在肝纤维化发生发展过程中的作用机制。

circRNA是一种新描述的非编码RNA(ncRNA)类型，具有生物稳定性、保密性和组织特异性 [23]。circRNA是一种共价闭合环状结构的RNA，没有5'端和3'端之分，主要由前体mRNA通过外显子的反向剪接形成。1976年，桑格及其同事在分离植物病毒和动物肝炎病毒时首次发现circRNA，并使用circRNA一词来记录这些病毒的结构 [24]。随着RNA测序和全基因组分析等高通量技术的发展，近年来对circRNA的研究呈爆炸式增长，越来越多的circRNA被鉴定出来，并对其功能进行了表征。circRNA根据其序列分为三组：外显子环状RNA (ecircRNA)、环状内含子RNA (ciRNA)和外显子–内含子环状RNA (EIciRNA) [25]。circRNA的主要功能是充当RNA结合蛋白(rbp)的海绵，调节转录并参与蛋白质翻译 [26]；这使得circRNA在人类疾病的发展中具有巨大的潜能。Yao [27] 等人观察到，ciRS-7通过充当“海绵”的作用抑制miR-7的活性，从而释放并增加肺成纤维细胞中靶基因TGF-β受体2 (TGF-β r2)的表达。进一步研究 [28] 发现，circ-PW-WP2A可通过充当miR-203和miR-223的分子海绵促进HSC的活化和增殖。Ji等 [29] 研究发现，Hsa_circ_0070963作为miR-223-3p的分子海绵，通过调节miR-223-3p和LEMD3来抑制HSC的激活，从而抑制肝纤维化。

纤维生成是一种慢性组织损伤或慢性炎症动态反应的结果，其中包括三个主要的连续过程：主要炎症反应、效应细胞激活的调节和ECM蛋白的过度生产 [30]。这些过程不是独立的，而是高度连接和协调的。通过分析现有的研究，发现circRNA对这些过程有不同的影响。TGF-β-和lps诱导的circ-PWWP2A上调与肝星状细胞(HSC)的激活和增殖呈正相关 [28]。Li等 [31] 发现hsa_circ_0004018/hsa-miR-660-3p/TEP1轴有助于HSC的增殖和激活。最近的一项研究表明，过表达圆形F box和WD 40结构域蛋白7 (circFBXW7)可以降低促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白细胞介素-1β (IL-1β)的循环水平，同时促进抗炎细胞因子IL-10的表达，可以防止炎症的加剧和肝纤维化的损害 [32]。然而，还需要进一步的研究来确定其他环状RNA是否可以抑制纤维形成。

5. 全反式维甲酸与HSCs

ATRA是动物体内维生素A的代谢中间产物，近些年发现其与肝纤维化发展关系密切。维生素A在肝脏中代谢储存为HSC中的视黄醇酯或全反式视黄酸，这是一种具有抗纤维化特性的活性代谢物 [33]。维生素A在肠上皮细胞中，以视黄醇酯或维生素A原β-胡萝卜素的形式获得的一种重要的膳食营养物质，视黄醇酯被包装成乳糜微粒，然后运送到肝细胞，在肝细胞中被水解成视黄醇。视黄醇在HSC中通过酶lethicin-视黄醇酰基转移酶(LRAT)酯化，然后以视黄醇酯的形式储存在HSC脂滴中。为了支持全身对视黄醇的需求，视黄醇酯从储存在星状细胞中被动员并水解成视黄醇，这是维生素A的主要循环形式 [34]。慢性肝损伤后，维生素A代谢通量紊乱，星状细胞活化导致类维生素A储存减少。

ATRA可通过抑制硫氧还蛋白互相作用蛋白(TXNIP)的表达抑制氧化应激，从而减弱HSCs的激活来抑制肝纤维化的发生发展。为了检测氧化应激是否参与HSCs的活化，Kanki等 [35] 用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理过度表达TXNIP的LX-2细胞，通过测定总谷胱甘肽量、α-SMA和COL1A1的mRNA水平，结果发现NAC通过激活GSH系统降低活性氧簇(ROS)从而抑制TXNIP过表达时HSCs的激活，表明氧化应激诱发HSCs活化。硫氧还蛋白(TRX)通过将二硫化物还原成巯基来抑制细胞ROS，TXNIP与TRX结合抑制TRX的抗氧化活性上调ROS。ATRA治疗后TXNIP表达被抑制，其对TRX抑制作用减弱，使ROS下调。ATRA通过对TXNIP作用使ROS下调，抑制了氧化应激，从而抑制了HSCs活化 [36]。

6. 总结

肝纤维化是一个复杂的变化过程，涉及多个事件，其中星状细胞的活化被认为是主要事件。在对细胞内和细胞外微环境刺激的反应中，被激活的造血干细胞与其他“有反应”的细胞相互作用，触发伤口愈合反应。这些“反应”细胞在造血干细胞活化过程中通过不同的分子机制和细胞信号转导发挥双重作用。旁分泌纤维原性趋化因子和分子信号激活或促进造血干细胞的激活，通过恢复、转分化或诱导星状细胞死亡和衰老来抑制星状细胞的激活和消除激活的星状细胞。破译星状细胞活化过程中细胞间相互作用的特定细胞机制，为肝纤维化的治疗干预提供新的见解至关重要。进一步的研究应集中在这些“反应性”细胞双重调控星状细胞活化的关键因素上，以便发现精确的肝纤维化干预策略。同时也了解到HSC在转录水平激活的起始和延续不是顺序的过程，在整个CLD甚至肝硬化期间发生，这让我们更深地了解到星状细胞在肝纤维化发展中的具体作用。目前已经发现ncRNA可通过多种途径调节肝纤维化，其调节肝纤维化的中心环节是HSC，另外，不同ncRNA种类之间，也会产生相互作用，例如前面提到的circRNA充当miRNA的分子海绵，但目前对于ncRNA之间相关联性的研究较少，因此，进一步研究不同类型的ncRNA之间的串扰和表观遗传之间的复杂级联，可能对于其在寻找治疗肝纤维化药物及新靶点的道路上具有巨大的潜力。ATRA近些年发现其与肝纤维化发展关系密切，相关研究也表明ATRA通过对TXNIP作用使ROS下调，抑制了氧化应激，从而抑制了HSCs活化。因此，进一步发掘ATRA与肝纤维化的关系，对肝纤维化的治疗可以提供新的思路。

NOTES

^*通讯作者。