1. 背景介绍
人类肠道病毒(Enteroviruses, EV)是一种具有约7500个核苷酸的单股正链无包膜的小型RNA病毒，属于小核糖核酸病毒属 [1] [2]，在人类中包括EV-A到EV-D多个亚型 [3]。EV广泛存在于自然界，主要通过粪口途径传播。EV感染引起的症状多种多样 [4]，通常无症状或导致轻微疾病，如普通感冒或轻微发热。国内外许多国家将EV视作“普通感冒”的重要病原体，也正是这些无症状感染者在病毒的传播过程中起了关键性作用 [3] [4]。EV也与严重疾病的暴发有关，如手足口病(HFMD)、疱疹性咽峡炎、脑炎、心肌炎和败血症等，其中最为常见的是手足口病。这些疾病具有相当高的发病率，严重时会导致死亡 [5]。
肠道病毒感染以柯萨奇病毒A组(Coxsaekievirus group A, CA)16和人肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)最为常见 [6] [7]。CA16及EV71对公共卫生的威胁日益严重，特别是在亚太地区，中国在2008年暴发的手足口病就以EV71和CA16为主要病原 [8]。随着肠道病毒的不断进化，手足口病的病原体也发生了变化，因此需要对肠道病毒感染引起足够的重视，早发现，早隔离，避免爆发性流行，以保证儿童的健康成长以及生命安全。
本研究中，我们收集了2021年杭州地区新生儿至1岁婴儿患者标本，这些患者的临床初步诊断结果为手足口病、疱疹性咽峡炎、脑炎或者惊厥等。通过对临床初步诊断结果及导致其感染的主要病原体进行分型，进一步了解杭州地区肠道病毒的优势型别，有助于提高疾病诊断率，从而达到早期治疗的效果，可获得较高的社会和经济效益。
2. 实验方案设计
2.1. 研究对象
收集2021年杭州地区4~10月份临床初步诊断为手足口病、疱疹性咽峡炎、脑炎、发热性惊厥等症状的患儿肛拭子或咽拭子标本60份，患儿年龄为新生儿至1岁内，均签署知情同意书。
纳入/排除标准：纳入标准1) 符合《手足口病诊疗指南(2018年版)》的诊断标准；2) 年龄为新生儿至1岁内。排除标准1) 未征得家长同意；2) 未收集到咽拭子/肛拭子标本；3) 没有完整的病史资料；4) 入院时合并其他感染性疾病者；5) 既往有运动、精神发育较同龄儿落后者。
2.2. 方法
2.2.1. 肠道病毒核酸提取
取140 μl样本，根据天根的病毒RNA提取试剂盒(天根DP419)提取病毒RNA；提取好的RNA用NanoDrop 2000 (美国Thermo)测定浓度和纯度，RNA样本保存于−80℃备用。
2.2.2. 逆转录反应
用Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒(FSQ-101, TOYOBO)，把RNA逆转录成cDNA。主要步骤简述如下：取4 μl RNA溶液加入1 μl Oligo (dT)，70℃变性5 min，冰上静置2 min，然后加入10 μl RNase Free H2O，4 μl 5×RT Buffer，1 μl Rever Tra Ace试剂。在PCR仪上按照如下程序进行逆转录：37℃ 45 min；98℃ 5 min。反应结束后，保存于−20℃备用。
2.2.3. 肠道病毒筛查
用肠道病毒核酸通用型引物和探针，对60份经逆转录获得的cDNA样品在ABI7500仪器上进行qRT-PCR (探针法)检测筛查。其中试剂是TOYOBO公司的THUNDERBIRDTM Probe qPCR Mix (QPS-101, TOYOBO)。
2.2.4. 肠道病毒阳性样本的CA16分型
筛查得到的肠道病毒阳性样本，用柯萨奇病毒A组16型(即CA16)设计的特异性引物在ABI7500仪器上进行qRT-PCR(SYBR green法)进行CA16分型检测。引物如下：CAP-F： 5’-TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3’，CAP-R：5’-ACCATTGGGTTTGGCTACG-3’。使用试剂为SYBR Green Realtime PCR Master Mix (QPK-212, TOYOBO)。
2.2.5. Sanger测序验证CA16阳性样本
分型检测到的CA16阳性样本，通过特异性引物CAP-F/CAP-R进行普通PCR扩增，PCR扩增所用试剂为HotStarTaq Master Mix (QIAGEN)，反应条件为95℃，15 min；94℃，30 sec，50℃，30 sec，72℃，30 sec，45个循环；72℃，10 min。PCR产物送擎科生物公司进行测序。
2.2.6. Sanger测序分析CA16阴性的肠道病毒阳性样本
在肠道病毒的VP1区设计能扩增几乎所有肠道病毒的引物：I-F： 5’-ATGTAYGT(dI)CC(dI)CC(dI)GG(dI)GG-3’；I-R:5’-GC(dI)CC(dI)GAYTG(dI)TG(dI)CCRAA-3’，进行两轮PCR扩增。PCR扩增所用试剂为HotStarTaq Master Mix (QIAGEN)，反应条件为95℃，15 min；94℃，30 sec，50℃，30 sec，72℃，30 sec，45个循环；72℃，10 min。PCR产物送擎科生物公司进行测序。
2.2.7. 序列分析
测序得到的序列与NCBI数据库中标准序列进行比对，初步确定肠道病毒型别后，进一步通过BioEdit和MEGA4生物软件，采用邻近法进行多序列比对构建进化树，对初筛结果进行审核，从而确定肠道病毒基因分型。
3. 结果
3.1. 新生儿至1岁内婴儿患者肠道病毒检出情况
本研究共收集杭州地区2021年度4~10月份新生儿至1岁内婴儿患者标本60份，共检出EV阳性样本29例，总阳性检出率为48%。其中在19例患者的咽拭子标本中，EV阳性有12例，占63%，是总样本数的20%，而肛拭子标本检测出EV阳性的为17个，占肛拭子标本数的41%，是总样本数的28%。具体检出情况如表1所示。
3.2. 新生儿至1岁内婴儿患者肠道病毒CA16检出情况
针对EV阳性的29例样本，通过CA16特异性引物初步筛选出CA16阳性样本12例。CA16的阳性检出率为41.3%。
3.3. 测序分析CA16阳性样本情况
随机选取CA16阳性样本6例，测序得到序列经与NCBI标准序列Blast比对后，确定肠道病毒CA16有5例，其中1例为假阳性，Blast结果如图1所示。
Figure 1. Diagram of sequencing comparison results on CA16 positive samples
图1. CA16阳性标本测序比对结果演示图
3.4. 测序分析CA16阴性的肠道病毒阳性分型情况
随机选取CA16阴性的EV阳性样本6例，测序得到序列经与NCBI标准序列Blast比对后，发现是肠道病毒CA6型，比对结果如图2所示。
3.5. 树图分析测序序列比对结果的准确性
通过测序获得CA16阳性标本5例的序列分别标记为：CAP3、CAP5、CAP8、CAP31和CAP36；EV其他分型CA6序列标记为I-primer62-1；这些序列与NCBI数据库中公布的代表序列构建进化树。结果显示，6株EV与相对应的原型株系聚在一起，该结果与NCBI比对结果一致。具体结果见图3：
Figure 2. Diagram of sequencing comparison results on CA6 positive samples
图2. CA6阳性标本测序比对结果演示图
注：该图采用邻近法(Neighbor-joining, NJ)制作病毒株系的基因进化树，bootstrap值为525，树状图的数值表示邻近株系的相似度，CAP36及I primer 62的CAP及I primer代表PCR扩增所用引物，其后数字表示本研究所用标本号，其他均为参考株系。
Figure 3. Phylogenetic tree of enterovirus sequences in Hangzhou in 2021
图3. 2021年杭州地区肠道病毒序列进化树
4. 讨论
肠道病毒是人类疾病的一个主要来源，主要发生在婴幼儿身上，而成年人感染较少 [8]。肠道病毒感染主要以CA16及EV71为主，但是最近几年，CA6及CA10病毒感染的患者日益增多 [7]。肠道病毒主要通过粪口途径及呼吸道方式传播 [4]。肠道病毒感染通常无症状或引起轻微临床症状，也可导致严重的并发症，包括心肌炎、脑炎、肝炎，甚至死亡 [5]。肠道病毒感染存在着时间性、区域性甚至是季节性等特点，不同年份、不同地区、不同季节流行的病毒型别都可能会有所区别，它们可能存在着交替和循环的现象。因此，对肠道病毒进行分型，从而了解肠道病毒的优势型别显得尤为重要。本研究收集新生儿至1岁内婴儿患者标本60份，分析肠道病毒CA16型及其他病毒的构成情况，收集的标本具有广泛性，包括杭州各个区的医院，在某种程度上能够反应2021年杭州地区肠道病毒的感染情况，了解该地区EV流行趋势，为疾病的诊断及早期治疗提供一定的帮助。
本研究发现肠道病毒CA16阳性数居多，其他肠道病毒阳性所占比例较小，从某种程度上可以说明，2021年杭州地区CA16肠道病毒为优势型别。在本研究中，只发现了一例CA6阳性标本。CA6阳性率低的确切原因还不清楚，样本例数不够或样本采集地区的覆盖率不够广泛可能是部分原因。近年来的数据显示，CA6的感染率在升高，它在很多呼吸道疾病中发挥越来越重要的作用 [4]。如重庆2013至2014年的检测结果为CA6阳性率67.2%，其他未分型EV阳性率26.6%，相比之下CA16仅占1.5% [9]。除此之外，在本研究中尚未发现EV71阳性标本，甚至还存在一些EV阳性标本难以判定型别，这也提示在以后的研究中，要更加关注非CA16其他EV型别的扩增实验，对其他型别进一步筛查和鉴定，以更加深入了解EV病毒流行规律，及时发现新的EV型别，从而提高诊断符合率，避免造成大范围的暴发。
肠道病毒感染是一个严重的全球公共卫生问题，尤其多发于婴幼儿时期，严重威胁着婴幼儿的健康及生命安全。肠道病毒主要通过粪–口途径感染(这个已多次提到，显得有些重复)，并在其生命周期早期以胃肠道上皮为目标，还可通过呼吸道传播，如肠道病毒D68，不干净的卫生环境及不良的卫生习惯对肠道病毒的传播过程非常重要 [10]。婴幼儿尚无安全卫生意识，且各部分器官尚未完全发育成熟，自身免疫力较差，对EV的抵抗力也相对较低，感染机会也就相对增多。所以，本项目的研究对象主要是新生儿至1岁内婴儿患者，旨在阐明其感染肠道病毒的种类及其流行特点，提示家长加强对婴幼儿的监护与管理，降低病毒的感染率，进一步保证婴幼儿的健康成长。
本研究存在一定局限性：由于肠道病毒的种类很多，而且保守序列很短，所以本研究的通用引物筛查肠道病毒阳性病例有一定的假阴性可能；另外本次研究虽然收集杭州多个区的样本，但入组的样本例数还是比较少的，得到的结论可能反映不了整个肠道病毒流行季的趋势；将来有关新生儿不同型别肠道病毒感染还需要增大样本量进行深入研究，以便为临床预防和治疗肠道病毒感染提供有力依据。
基金项目
浙江省医药卫生科技计划项目2019KY524；杭州市农业和社会发展科研计划20191203B122。
NOTES
*通讯作者Email: liuwei19740526@sina.com