锰氧化菌筛选、特性分析及在环境修复领域的应用

Screening and Characterization of Manganese(II)-Oxidizing Bacteria, and Its Application in Environmental Remediation

摘要: 近年来，越来越多的学者发现锰氧化菌在环境修复领域具有较大的应用潜力。锰氧化菌是一类能够将Mn(II)氧化成Mn(III/IV)等难溶性生物氧化锰的微生物，而生物氧化锰的特殊结构决定了其在环境修复中的重要作用。不同锰氧化菌的生存条件和性能均不相同，对污染物的固定效率和降解能力也不相同，因此，研究锰氧化菌及其诱导生物氧化锰的矿物特征对重金属和有机污染环境修复具有重要的科学意义。本研究介绍了锰氧化菌的筛选、特性分析及在环境修复领域的应用，并展望了锰氧化菌在环境修复领域的应用前景和面临的挑战，为后续其在环境修复领域的应用提供参考。

Abstract: In recent years, more and more scholars have discovered the potential application of Mn(II)-oxidizing bacteria in the field of environmental remediation. Manganese-oxidizing bacteria are a class of microorganisms that can oxidize Mn(II) into insoluble biogenic Mn(III/IV) oxides. The special structure of biogenic Mn oxides determines its important role in environmental remediation. Different Mn(II) oxidizing bacteria have different living conditions and performances, and their immobilization efficiency and degrading ability to pollutants are also different. Therefore, it is important to study the mineral characteristics of Mn(II)-oxidizing bacteria and their induced biogenic Mn oxidation for the remediation of heavy metals and organics pollution. In this study, the screening, characteristic analysis and application of Mn(II)-oxidizing bacteria in the field of environmental remediation were introduced. Finally, the application prospects and challenges of Mn(II)-oxidizing bacteria in the field of environmental remediation were prospected, providing a reference for subsequent applications in the field of environmental remediation.

1. 引言

随着我国经济及工业的快速发展，重金属元素发挥了重要的作用，同时伴随着资源的利用，大量重金属元素渗入地下，严重污染了人居环境。锰是地球上含量丰富的元素之一，大量地分布于水体、土壤及海洋中。锰氧化物(III/IV)由于其特殊的结构性质，能够吸附大量的重金属离子，且锰氧化物是已知的土壤中氧化还原电位最高的天然矿物(E₀ (MnO₂/Mn²⁺) = 1.22 V)，能够氧化多种金属及有机物 [1]。因此，现阶段锰氧化物在环境修复领域的应用具有重大科学意义。

锰氧化菌是一类能够将Mn(II)氧化成锰氧化物的一类微生物，其诱导产生的锰氧化物，即生物氧化锰(Biogenic Mn oxides, BMO)具有特殊的空穴结构，对多种污染物具有良好的吸附固定和降解能力 [2]。不仅能够去除水中的Mn(II)，而且能够有效去除重金属离子，在水体净化与土壤修复等环境修复方面具有重要意义 [3]。锰氧化菌因为其巨大的应用潜力而被人们所重视，为解决重金属和有机污染问题提供了良好的思路，但大规模应用还需要更多深入研究，尤其是锰氧化菌的氧化机制及其对环境的适应能力。基于大量学者的研究，本研究系统地综述了锰氧化菌的筛选、诱导矿物特征以及在环境修复领域的应用。

2. 锰氧化菌的筛选

锰氧化菌的筛选媒介一般为锰含量丰富的土壤、锰矿样品或生物除锰滤池。常用的富集培养基主要有PYG培养基、PYCM培养基、LB培养基等，培养基的pH均在7.0左右，各培养基的组成成分有区别：如PYG培养基的成分包含蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏这些细菌生长所需的有机物质，还包含所需的无机物质如CaCl₂·2H₂O、MgSO₄ ·7H₂O [4]；而PYCM培养基(每升)包含0.8 g蛋白胨、0.2 g酵母粉，无机物质包括0.1 g K₂HPO₄，0.2 g MgSO₄·7 H₂O，0.2 g NaNO₃，0.1 g CaCl₂，0.1 g (NH₄) ₂CO₃，1.0 g柠檬酸铁铵 [5]；LB培养基(每升)配方为 [6]：酵母膏10 g，蛋白胨5 g，氯化钠10 g。为了筛选出能够氧化锰的菌种，需要在培养基中加入锰离子，为防止MnCl₂在高温灭菌时被氧化，待已灭菌的无锰培养基冷却至室温后，再将MnCl₂和HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液通过0.22 μm微孔膜过滤加入。高浓度的Mn(II)能够抑制一些细菌的生长，因此培养基中对Mn(II)具有较高耐受性的细菌得以富集，因而不同Mn(II)浓度培养基里的微生物群落结构不同 [7]。

3. 锰氧化菌的鉴定

锰氧化能力的判断是锰氧化菌鉴定的关键，主要包括传统的观察法和指示剂法。观察法是利用锰氧化物的颜色鉴别锰氧化菌，但是这种宏观的观察法存在一定的偏差，不能确定产生的有色物质是否为锰氧化物。目前常用的指示剂法更为高效，在多种指示剂法中，Leukoberbelin blue (LBB)试剂能够与锰氧化物发生反应形成LBB-Mn(III)蓝色络合物，并且有明显的颜色变化 [8]，而且能够排除多种因素的干扰，是目前较为常用的鉴定方法。另外，也可通过扫描电镜或透射电镜等观察细菌胞外生物氧化锰的存在状态，用于辅助判断生物氧化锰的产物特征 [9]。

菌种的谱系鉴定通常采用16S rDNA序列比对法，即以菌株的基因组DNA作为PCR反应的模板，利用16S rDNA的通用引物27 F和1492 R进行PCR片段基因扩增，将PCR产物的16S rDNA基因序列在GenBank进行BLAST同源性对比，结合菌体形态特征和生理生化特征确定该菌种的物种分类学信息。

4. 锰氧化菌的分类

近年来国内外学者对锰氧化菌的特性及其锰氧化机制开展了大量研究。现阶段已经发现的锰氧化菌包括细菌和真菌，包括异养型锰氧化菌和自养型锰氧化菌。研究较为深入的锰氧化菌属包括：生盘纤发菌属(Leptothrix discophora)包含SS-1等，如张文强等 [10] 研究证实了生盘纤发菌不仅可以实现锰铁氧化物在胞外菌鞘的沉积，而且可以控制产物中锰、铁的比例，实现可控锰铁含量的复合氧化物的生物制造；节杆菌属(Arthrobacter)包含HW-16等，如万文结等 [7] 实验发现不同Mn(II)浓度下微生物群落结构不同，在PYCM-2000和3000培养基中优势属均为节杆菌属，该菌主要通过产生锰氧化活性因子和释放碱性产物提高体系pH这两种方式来催化氧化Mn(II)；芽孢杆菌属(Bacillus)包含SG-1、MB-1、CP133等，如刘颜军等 [11] 实验探究了锰氧化菌MK3-1的锰氧化特性，发现产生的锰氧化物均匀地分布在细菌的表面且含量较高，推测该菌锰氧化物的产生和运输机理很可能与已报道的不同；假单胞菌属(Pseudomonas)包含MnB1、GB-1和QJX-1等，如Caspi等 [12] 研究表明，P. putida MnB1的锰氧化功能基因主要为ccmE、ccmF、ccmA等；周娜娜等 [4] 的实验提取出来的Pseudomonas sp. QJX-1含有锰氧化的必需成分多铜氧化酶基因CumA，而且发现在贫营养条件下能更好地进行锰氧化，地下水处理过程中生物锰氧化速率较快，具有水处理的潜力；氨基杆菌属(Aminobacter)包含H1等，如H1主要是通过产生锰氧化活性因子和碱性代谢产物提高pH两个因素共同作用，通过吸附大量去除培养基中的锰，然后将吸附的锰氧化成生物氧化锰或作为自身生长所需要的营养元素 [5]。随着对于锰氧化菌研究的深入，新型的锰氧化菌在实验过程中不断被发现，未来一定会对锰氧化菌有更加明晰的分类和研究。

5. 锰氧化菌诱导生物氧化锰的形成机制和特性分析

目前细菌的锰氧化机制研究表明细菌可以通过分泌某种物质直接催化或者通过改变周围环境因子间接催化氧化锰。许多学者用分子生物学方法对锰氧化菌进行了研究，发现许多基因参与锰氧化过程中比如MofA、CumA和MnxG等 [13]，但近来研究发现，锰氧化菌的差异其诱导生物氧化锰的机制也有所不同。Tebo等 [14] 综述了P. putida MnB1、P. putida GB-1及Bacillus sp. SG-1等锰氧化菌基因种类，菌株不同时其功能基因不同。锰氧化菌对Mn(II)的氧化主要为单电子转移，而不是双电子转移(Mn(II)至Mn(IV))，即Mn(II)先转化为Mn(III)，然后Mn(III)再转化为Mn(IV)。晏平等 [5] 以Aminobacter为实验菌株，研究了生物氧化锰的形成机制，其实验过程中可以捕捉到Mn(III)中间体，所以可以推测，细菌氧化Mn(II)的过程可能是先氧化成Mn(III)然后再向高价态氧化，也有可能是先氧化成Mn(III)然后通过歧化反应生成Mn(Ⅱ)和高价态的锰。另外，也有研究认为，胞外在超氧自由基在Mn(II)氧化过程中起到重要作用。例如，Learman等 [15] 以Roseobacter sp. AzwK为实验菌株，证实超氧自由基能够直接氧化Mn(II)为Mn(III)，其中超氧自由基的产生速率为1.0 μM/min。

生物锰氧化物因为其特殊的结构及性质呈现出不同的矿物特征，常用X-射线衍射(X-ray diffraction, XRD)技术分析物质形态及组成。与化学成因的锰氧化物相比，生物氧化锰具有更差的晶型，新生成的生物氧化锰具有较多的Mn(IV)空缺，正是由于这种特殊结构使其作为吸附剂能够吸附多种重金属污染物 [16]。Tebo等 [17] 研究认为，初期形成的生物氧化锰主要以δ-MnO₂为主，矿物结构以MnO₆八面体为基本单元，含有大量氧空穴，比较面积大，带有负电，当Mn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺等金属离子注入时，会改变生物锰氧化锰的矿物结构，影响其活性。Lefkowitz等 [18] 研究发现，Ni²⁺主要吸附于δ-MnO₂的层状空隙点位。基于这种结构，孟佑婷 [19] 使用具有多级孔隙结构的丝瓜络固定氧化锰，制成植物–微生物复合吸附剂LIBMOs，并通过实验证明该复合吸附剂具有较强的吸附潜力，提供了污染修复的新思路。

6. 锰氧化菌在环境修复领域的应用

6.1. 吸附固定重金属

生物氧化锰对重金属离子的吸附作用可以有效去除环境中的重金属离子。部分生物氧化锰能够发生结构变化使重金属离子更容易进入结构的空穴，从而增大了吸附效率。生物氧化锰对于常见重金属，如Cu等具有较好的吸附容量 [20]，在较短时间内可以达到平衡，具有良好的实用价值。近来，从陆地土壤铁锰结核及其邻近土壤中分离筛选得到高锰氧化活性的细菌菌株，应用这些菌株合成的生物氧化锰对重金属Cu、Zn、Cd、As的吸附能力远大于化学合成锰氧化物的吸附能力 [21]。Bai等 [22] 以Pseudomonas sp. QJX-1为实验菌株，其构建的生物反应器对水中As具有良好的吸附固定作用。宋宜等 [23] 研究发现，生物氧化锰对三价砷具有较强的亲和能力，能够快速氧化和固定土壤中的三价砷，将三价砷转化成为不活泼的五价砷，从而降低砷的毒害程度。添加三价铁能够促进土壤中砷由可交换态、专属吸附态向无定型铁锰结合态和结晶型铁锰结合态转变，环境风险由中风险转变为低风险，土壤中砷的化学稳定化增强，其水解过程中产生的水铁矿和四方纤铁矿等次生铁氧化物能够有效吸附固定土壤中的砷，进而显著提高砷的稳定化效率。Wang等 [24] 以P. putida MnB1为供试菌株，其诱导生物锰氧化锰对土壤中砷具有良好的修复效果。此外，相关研究表明，中等风险的砷污染原土经生物氧化锰处理后风险指数(RAC)值降至11.46%，接近低风险 [25]。可见，生物氧化锰是一种可用于砷污染土壤修复的环境友好型生物材料。

6.2. 降解有机污染物

生物氧化锰广泛参与到地球生物化学循环中，在多种有机物的降解中发挥着重要作用，对新兴污染物的治理有潜在的应用。目前受关注较多且潜在风险较大的新污染物，包括内分泌干扰物(EDCs)、个人护理产品(PPCPs)、抗生素、雌激素等，如邻苯二甲酸酯类、抗生素类、双酚化合物、植物雌激素等，尽管它们在环境中浓度极小，但是一旦进入人体和动物体内，便可以与特定的激素受体结合，进而诱导产生雌激素，或者进一步与生物体DNA特定的片段结合，使DNA序列或构象发生变化，干扰内分泌系统的正常功能 [26]。

研究表明，生物氧化锰能够有效降解环境中有机污染物。P. putida QYS-1产生的生物锰氧化物能在较短的反应时间下使得绝大部分刚果红和部分甲基橙分子结构被破坏，在偶氮染料废水的脱色方面发挥着作用，但是随着循环利用次数的增加，其自身活性及对偶氮染料的脱色作用显著降低 [27]。Li等 [28] 研究了Pseudomonas sp. F2对氧氟沙星的降解效率，其发现该菌株对5 μg/L氧氟沙星的去除率为100%。Shobnam等 [29] 研究了锰氧化菌对双酚A的去除机制，其发现生物氧化锰对双酚A的降解起主要作用。翟俊等 [30] 通过研究自养型锰氧化菌及生物氧化锰对双氯芬酸的降解，证明锰氧化菌经过适当的开发可成为一种新的低成本、低环境风险的去除环境中双氯芬酸等新兴污染物的材料。生物氧化锰对环境中17β-雌二醇(E2)的氧化降解具有正向的作用 [31]。实验证明少量氧四环素能够促进细菌多铜氧化酶基因cumA的表达，提高了生物氧化锰的生成速率，增强对氧四环素的去除效果 [32]。翟俊等 [33] 研究生物氧化锰对乙炔基雌二醇(EE2)的去除作用，pH值为4.0、生物氧化锰投加量为20 mg/L时，EE2的去除率可达97.7%，其中生物氧化锰的贡献率达到76.9%。

7. 未来与展望

(一) 锰氧化菌种类丰富，且分布广泛，但是目前对于锰氧化菌的研究还不成体系，对于菌株的种类研究的较少，未来有望形成具有完整分类的锰氧化菌体系。

(二) 细菌参与的锰氧化生理生态机制方面还未探究清楚，仍需进行大量的实验探究过程中的相互作用关系。另外，锰氧化菌对新兴有机污染物的降解有待深入研究。

(三) 锰氧化菌用于实际污染环境修复仍需要大量实验研究，如何原位修复重金属和有机污染土壤环境，如何让生物氧化锰在最佳条件下适应环境存活并修复污染，是未来需要研究并有望实现的。

基金项目

国家自然科学基金(41907111)和青岛理工大学大学生科技创新项目(KJCXXM093)。