补肺一号方通过TGF-β1/Smad通路抑制慢阻肺大鼠肺纤维化

Tonic Lung of NO.1 Inhibite Pulmonary Fibrosis in COPD Rats through TGF-β1/Smad Pathway

摘要: 目的：熏香烟联合气道内滴注脂多糖(LPS)法制造慢阻肺(COPD)大鼠模型，研究我省名老中医陈志斌教授经验方补肺一号方对COPD大鼠肺纤维化的抑制作用。方法：选择30只3周龄SPF级别SD大鼠随机分为空白组、模型组、补肺一号方低剂量组、补肺一号方中剂量组、补肺一号方高剂量组，其中模型组、中药组给予香烟联合气道内滴注LPS (1 mg/kg)建立COPD模型，低、中、高剂量组分别采用每天灌胃1.5 g/(kg∙d)、3.0 g/(kg∙d)、6.0 g/(kg∙d)干预，空白组、模型组灌胃生理盐水。8周后，HE染色观察大鼠肺组织，Western blot检测肺组织TGF-β1、Smad蛋白表达量。结果：与空白组比较，模型组气道及肺泡破坏严重，肺组织TGF-β1、Smad蛋白显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，低、中剂量组气道及肺泡结构恢复正常，TGF-β1、Smad蛋白显著降低(P < 0.05)。结论：补肺一号方能改善COPD大鼠肺组织炎症，这可能与其能抑制TGF-β1/Smad通路，减轻氧化应激及炎症损伤有关。

Abstract: Objective: The rat model of COPD was made by smoking cigarettes combined with airway dripping of lipopolysaccharide (LPS), to investigate the mechanism of inhibition of pulmonary fibrosis in COPD rats of tonic lung of NO.1 by professor Chen Zhibin, a famous old traditional Chinese medicine doctor in our province. Methods: Thirty 3-week-old SPF SD rats were randomly divided into blank group, model group, low/medium/high-dose groups. Model group and medicine groups were given cigarette combined with LPS (1 mg/kg) to establish COPD model. Medicine groups were given 1.5 g/(kg∙d), 3.0 g/(kg∙d) and 6.0 g/(kg∙d). Blank group and model group were given physiological saline. After 8 weeks, lung tissues of rats were observed by HE, and the expression levels of TGF-β1 and Smad proteins in lung tissues were detected by Western blot. Results: Contrast to the blank group, the airway and alveolar in model group were notably breaked, and TGF-β1 and Smad proteins in lung tissues were remarkably enhanced (P < 0.05). Contrast to model group, the airway and alveolar in low and medium dose groups were back to regular, while TGF-β1 and Smad proteins were remarkably reduced (P < 0.05). Conclusion: Tonic lung of NO.1 can improve lung inflammation in COPD rats, associated with the restrain of TGF-β1/Smad pathway and the reduction of oxidative stress and lesions.

1. 引言

慢性阻塞性肺疾病(COPD)最主要的病理生理改变是气流受限 [1]，最主要的病理基础是炎症，大量的炎症因子风暴如IL-6、TNF-α在促进COPD早期炎症，TGF-β1则可促进成纤维细胞迁移、转换成肌纤维细胞，产生大量细胞外基质，最终形成纤维细胞灶 [2] [3]。从中医角度，COPD和肺纤维化病机都是气阴两虚、痰瘀阻肺。笔者所在团队便是从益气养阴祛瘀角度运用补肺一号方治疗慢性阻塞性肺疾病患者获得很好的临床疗效，大大提高了患者FEV1和6分钟步行距离。本次研究通过建立COPD模型大鼠，探讨补肺一号方对COPD大鼠肺纤维化的影响及可能机制。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 试剂

水合氯醛(Aladdin, K913111)、香烟(安徽中烟工业有限公司，1042930159292532)、LPS (sigma, MB5198)、Smad3 (Proteintech, 66516-1-Ig)、Smad7 (Proteintech, 25840-1-ap)。补肺一号方(黄芪18 g，刺五加9 g，黄精15 g，仙鹤草18 g)，由我院中药房一次性购齐、鉴定、称取，浸泡30 min，煎煮20 min两次，煎煮液浓缩至1 kg/L，分装后4℃冰箱备用，使用前超纯水稀释后37℃水浴预温。

2.1.2. 仪器

自制吸烟箱、移液器(德国eppendorf)、酶标仪(美国伯乐公司)、DHG-9091A干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、自动组织脱水机(湖北孝感阔海医疗科技有限公司，KH-TS)、包埋机(湖北孝感阔海医疗科技有限公司，KH-BL)、超纯水机(法国Millipore MILLI-Q)、电泳仪及半干转膜仪(美国伯乐公司)、Gel View 6000化学发光凝胶成像系统(广州云星仪器有限公司)。

2.2. 方法

2.2.1. 应用熏香烟联合气道内滴注脂多糖(LPS)的方法造成大鼠COPD模型 [4]

经动物伦理委员会审查同意后，选择30只3周龄，体质量(200 ± 20) g，SPF级别SD大鼠。适应环境3天后，随机分空白组、模型组、补肺一号方低/中/高剂量组。① 模型组、中药组：于实验的第1和第14天将LPS (1 g/L)经大鼠气道内缓慢注入，200 μg/次。每天将大鼠暴露于点燃10支香烟的吸烟舱内2小时，共持续8周。② 空白组：大鼠于实验的第1和第14天经气道内注入等量的0.9%氯化钠，与模型组在同等的条件下(室温、安静、避强光)正常饲养。建模28 d后开始药物干预，每天一次，方法如下：1) 空白组、模型组灌胃0.9%氯化钠10.0 ml/(kg∙d)。2) 中药组分别灌胃补肺一号方1.5 g/(kg∙d)、3.0 g/(kg∙d)、6.0 g/(kg∙d)。持续给药28 d，给药过程中继续进行吸烟造模。

2.2.2. HE染色

取左肺用0.9% NaCl冲洗，福尔马林浸泡固定后切片，分别行15 min、15 min、10 min脱蜡三次；分别用100%、90%、80%、70%的酒精脱苯10 min；蒸馏水冲洗，苏木素染核，0.5%的盐酸酒精分色；再冲洗，酒精浸泡，复染伊红，酒精分化脱水，二甲苯透明3次，最后用中性树脂封片观察。

2.2.3. Western Blot检测肺组织中TGF-β1、Smad蛋白

取右中叶肺组织，PBS清洗3次，裂解提取总蛋白并检测总蛋白浓度，转移蛋白质至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，加入一抗于4℃封闭过夜，次日加入二抗室温封闭1 h，显色并统计灰度值计算相对表达量。

2.3. 统计学分析

所有数据均用SPSS23.0进行分析，实验结果以 $\bar{x}\pm s$ 表示。方差齐且服从正态分布则组间比较用One-Way ANOVA，反之则用秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 各组大鼠HE染色观察肺组织结构变化

HE染色实验显示，与空白组相比，模型组大鼠气道严重变形，肺泡融合，炎性细胞浸润；与模型组相比，低、中剂量组大鼠气道、肺泡结构相对完整，少见肺大泡，炎性细胞浸润现象明显减轻，中剂量组改善尤其显著，提示补肺一号方对COPD大鼠肺组织有显著的保护作用。高剂量组气道及肺泡结构紊乱，大量炎性细胞浸润，提示可能存在毒性作用。(图1)。

3.2. Western Blot检测

结果显示：与空白组比较，模型组肺组织中TGF-β1、Smad3蛋白水平显著升高；与模型组比较，低、中剂量组肺组织中TGF-β1、Smad3蛋白显著下降，中剂量组最为显著(图2)，而高剂量组则显著升高。

Figure 1. The evaluation of lung tissue cells morpholog though HE (×200)

图1. HE肺组织细胞形态(×200)

注：^*与空白组对比P < 0.05，^#与模型组对比P < 0.05，^##与模型组对比P < 0.01

Figure 2. The expression level of factors in lung tissue by western blot

图2. 免疫印迹实验检测肺组织中TGF-β1、Smad3蛋白( $\bar{x}\pm s$ )

4. 讨论

大量炎症细胞聚集的炎症反应是COPD病理的基础和核心，病变由上及下，直至侵犯细支气管和肺泡，损伤–修复过程持续存在，最终导致肺纤维化 [5]。本研究显示，相比空白组，模型组气道及肺泡结构严重破坏，炎性细胞、成纤维细胞聚集；补肺一号方低、中剂量干预后气道及肺泡结构恢复完整性，炎性细胞、成纤维细胞聚集现象明显减轻；而补肺一号方高剂量导致气道及肺泡结构紊乱，加重炎症反应，提示高剂量可能存在毒性作用。

TGF-β1是纤维化发生发展的“开关”，Smad蛋白是TGF-β信号通路传导过程中关键的受体后信使蛋白，通过调控靶基因的转录来建立细胞质与细胞核之间的通路，促进纤维化的形成 [6]。本研究显示，补肺一号方低、中剂量组可显著下调肺组织中TGF-β1、Smad3蛋白的表达，而高剂量组截然相反。

“补肺一号方”乃福建省名老中医陈志斌教授的经验方，由黄芪、刺五加、黄精、仙鹤草四味药组成，方中黄芪补气固表为君；刺五加益气健脾为臣药，配合黄芪补肺气；黄精益气养阴、健脾润肺，仙鹤草补虚益气，佐以黄芪补益之功。本方精简至极，兼具补肺健脾、益气养阴之效，长期应用于COPD患者可改善机体自身免疫调节 [7] [8] [9]。

综上所述，本研究显示补肺一号方可能通过TGF-β/Smad通路抑制慢阻肺大鼠气道及肺泡的炎症反应，抑制肺纤维化进展。但高剂量服用可能造成毒性反应，加重肺组织损伤，应严格掌握安全剂量。

基金项目

本文为福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2020GGA066)；福建中医药大学校管临床专项课题(XB2020020)。