荆州市花生白绢病菌的分离鉴定

Isolation and Identification of Pathogen of Peanut Southern Blight in Jingzhou City

摘要: 为明确引起湖北省荆州市花生白绢病的病原菌种类，本试验采用组织分离法、形态学鉴定法和基于ITS基因序列的分子鉴定法，对采自荆州市具有典型白绢病症状的花生植株进行病原菌的分离、纯化和鉴定。结果表明，引起花生白绢病的病原菌(QZ)被鉴定为罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)，属于担子菌亚门真菌；其无性态为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，属半知菌亚门真菌。

Abstract: To identify the pathogenic fungus that caused peanut southern blight in Jingzhou City of Hubei Province, the pathogens of peanut southern blight were isolated, purified and identified using the methods of tissue isolation, morphological identification, and molecular identification, which is based on ITS. The pathogenic fungi (QZ) that caused peanut southern blight were identified as Athelia rolfsii, which belonged to the subphylum basidiomycete fungus. The unnatural state is Sclerotium rolfsii Sacc., which belongs to the subphylum hemiknophyllum.

1. 引言

花生(Arachis hypogaea L.)是全世界上重要的经济作物之一，种植面积在油料作物中高居第二，是人类生产生活中的重要作物 [1]。近年来，随着感病品种植面积的增多、田间栽培措施的改变以及化肥农药的过量使用等，花生白绢病也趋于严重，现已成为我国各大花生产区的重要病害之一 [2] [3]。

花生白绢病(Peanut Southern Blight)于1931年首次在南非发现 [1]，是由Sclerotium rolfsii Sacc.造成的一种严重病害 [4]。该病害自发生以来，现已遍及全球各大花生种植区。乔治亚州拥有美国最大的花生生产区，每年由花生白绢病造成的产量损失为25%~80%，损失估计为3680万元 [5]；位于阿根廷的科尔多瓦省南部的花生产区从1991年至1994年由该病害造成的产量损失高达34% [6]；伊朗桂兰省花生种植区因花生白绢病的发生造成的产量损失在10%~25%之间 [7]。近年来，花生白绢病在我国辽宁、广东、河南、江西、山东等省份的部分花生生产区大面积发生，其发病率在10%~30%之间，造成花生的大面积减产并引起严重的经济损失 [8] [9] [10] [11] [12]。2004年，山东省临沂市病害发生面积为60,000 hm²，经济损失高达9000万元 [12]。

花生白绢病的寄主范围非常广泛，很多作物如辣椒 [13]、芝麻 [14]、苹果树 [15]、烟草 [16]、铁皮石斛 [17]、茉莉 [18]、韭菜 [19]、草莓 [20]、魔芋 [21]、柳叶白前 [22]、太子参 [23]、紫菀 [24] 等均受到了白绢病的危害。引起花生白绢病的真菌的无性态齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，其菌落在培养基上呈白色细丝状，菌丝扭结则开始形成菌核，不产孢子。菌核初期为白色，颜色逐渐变黄至褐色或者深褐色，切开菌核内部呈灰白色；菌核质地较硬，表面光滑，形状为球形或不规则球形。其有性态为罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)，但在自然环境和人工培养均不常见。花生白绢病在高湿、高温、空气流通差的条件下较易发生 [25]，可以在花生的整个生育期造成危害。其危害部位主要在花生根部、茎基部、果柄等部位。病原菌可侵染病植株的茎基部时，侵染部位和邻近土壤能够形成白色绢丝状菌丝，因此被称为白绢病。发病初期病株茎基部颜色逐渐变深，一段时间后会出现白色菌丝，随着菌核的形成，其自身颜色逐渐变深为黄褐色；病原菌侵染植株的叶片时，叶片会出现变黄、腐烂等症状 [26] [27]。

对于花生白绢病的防治研究早有报道。1987年Branch等人 [28] 首次在美国进行花生抗白绢病的试验研究，并在田间接种条件下鉴别出一些具有抗性的品种。Xie等 [29] 在美国南部采集了84株花生白绢病株并进行致病力和表型多样性研究，结果表明从花生上分离出的菌株致病力最高。Shoke等人 [30] 测试了田间120个花生基因型，发现了中抗型Southem Runner型，感病型的Florunner型。Jebaraj等人 [31] 研究发现花生被不同白绢病菌分离物侵染后，不仅影响种子的萌发率，且在病情指数和死亡率上均存在差异。杨家珍是我国针对花生白绢病进行防治的最早研究者，在1957年开始对花生白绢病的发展情况展开调查，并进行药剂防治的初步研究 [32]。谢瑾卉等人 [33] 为研究室内花生白绢病的药效而采用了9种杀菌剂，结果表明三唑类杀菌剂己唑醇对白绢病菌的毒力最强。陆燕等人 [34] 研究发现解淀粉芽孢杆菌对花生白绢病有较好的生防效果。李亮亮等人通过平板对峙试验和菌丝生长速率法筛选出的解淀粉芽孢杆菌，不仅可以抑制花生白绢病菌菌丝的生长，还能抑制菌核的产生 [4]。

荆州市位于湖北省中南部，年平均气温15.9℃~16.6℃，年降雨量1100~1300 mm，花生是当地重要油料和经济作物之一 [35]。近些年来，花生白绢病已逐渐成为当地花生生产上的常发病害之一，并对该地花生产量造成较大影响，但对当地花生白绢病病原菌的研究和报道较少。本文通过对荆州市花生白绢病的病原菌进行分离，纯化以及进行形态与分子学的鉴定，以期为该病害的进一步研究提供参考。

2. 材料与方法

2.1. 试验材料

花生白绢病菌分离自2021年9月从湖北省荆州市通过五点取样法采集的花生病株，命名为QZ。

2.2. 试验方法

2.2.1. 菌株的分离

采用组织分离法：在花生植株的发病与健康相交处分别剪取5 mm长的茎段和5 mm见方的叶片，用75%的酒精对材料和工具进行表面消毒后于超净工作台中进行操作。先用75%的乙醇处理30 s，再用30%次氯酸钠处理2 min，之后用无菌水冲洗3遍，最后用无菌滤纸吸干组织上的水分后转接到PSA培养基上，然后置于25℃培养箱中黑暗培养至萌发菌丝。每天观察菌丝的生长情况。

PSA培养基：200 g新鲜马铃薯去皮煮汁，蔗糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水定容至1000 mL。

2.2.2. 菌株的纯化和保存

培养菌落至菌丝快要铺满整个培养皿时，用打孔器在菌落边缘打取直径为6 mm的菌饼重新接种到PSA平板中央进行纯化，然后置于25℃培养箱中进行黑暗培养，重复这一过程直至获得单一纯种菌落。获得纯化菌株后，一份用接种环勾取菌丝进行斜面保存，放4℃冰箱中备用；一份将打取的菌饼置于灭菌的50%的甘油管中于−80℃超低温冰箱中长期保存。

2.3. 病原菌的鉴定

2.3.1. 形态学鉴定

在纯化后得到的病原菌QZ的菌落边缘打取菌饼，将其转接到新的PSA平板中央，并于25℃黑暗条件下培养，三天后观察菌落的形态及颜色；在新转接的PSA平板的菌饼周围插入无菌盖玻片，相同的培养条件下培养两到三天后，取下盖玻片在显微镜下观察菌丝的形态以及有无隔膜等；继续对其进行培养，观察菌核的颜色、形状、大小和色泽等。

2.3.2. 分子生物学鉴定

采用CTAB法提取病原菌菌株的DNA，具体操作如下：

将菌株接种在PSA平板上，在25℃培养箱中黑暗条件下培养三天，收集适量菌丝体，液氮速冻，用研磨棒将菌丝研磨成粉状，然后转移至2 ml的无菌离心管中。加入600 ul CTAB溶液，在65℃水浴锅中静置30 min，每隔10 min进行翻转混匀。加入等体积的DNA提取液，在离心管中混匀，室温下在水平摇仪上轻摇20 min，50 rpm，然后进行4000 rpm，5 min离心。将上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，室温下在水平摇仪上轻摇20 min，50 rpm，然后进行4000 rpm，5 min离心。将上清液转入新的离心管中，加入1/10体积3摩尔每升的醋酸钠溶液和2倍体积的100%乙醇。在4℃，10,000 rpm条件下，离心10 min，使DNA沉淀。离心后弃去上清，先用75%的乙醇清洗沉淀，再用100%的乙醇清洗一遍，晾干后用无菌水溶解沉淀，测量浓度后于−20℃保存。

利用16S rDNA对菌株QZ进行分子生物学鉴定。以提取菌株的DNA为模板，对病菌进行PCR扩增。使用真菌核糖体基因内转录间隔区(rDNA-ITS)通用引物序列：ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反应程序：94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35 cycles；72℃ 5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用凝胶成像仪来观测PCR产物的大小，将符合要求的PCR扩增产物交由擎科生物科技有限公司进行测序。将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对分析。

2.4. 构建系统发育树

将测得序列上传到GenBank数据库进行比对，选取并下载相似度较高的菌株序列，用MEGA 7.0软件中的ClustaIW进行序列比对后，选择NJ (Neighbor-Joining)算法构建系统发育树。

3. 结果与分析

形态学鉴定

分离菌株QZ的生长结果见图1。菌落颜色呈白色，边缘均匀，菌丝为细丝状，有光泽，从中央向四周辐射生长。显微镜下观察到菌株QZ的菌丝呈淡灰色，有隔膜，多分枝，且分支多为直角。经观测可知，QZ菌株生长速度较快，培养箱25℃条件下培养三天左右，即可长满直径为90 mm平板。继续培养菌丝体交叉缠结即开始形成菌核，开始为白色，逐渐变为黄色，最后转为深褐色。菌核多为球形，或不规则球形，大小不一，内部灰白色，表面光滑，有光泽，质地坚硬，在培养皿中分布不均匀。以上形态学特征及《作物病虫害诊断与防治彩色图谱》 [36] 和相关文献表明，可以将造成荆州市花生白绢病的真菌初步鉴定为罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)。

Figure 1. Characteristic of colony, mycelium and sclerotium from strain

图1. 菌株的菌落、菌丝和菌核形态

分子生物学鉴定

将QZ菌株的DNA作为模板，对其ITS序列进行PCR扩增。结果见图2，扩增产物经电泳检测后，结果约为650 bp的单一条带。将菌株QZ的16S rDNA序列进行测序，可得到长度为660 bp的基因序列。将菌株QZ的序列与GenBank数据库中的序列进行Blast比对，将比对获得的同源序列与测定序列进行同源性比较，构建系统发育树见图3。从图中可看出菌株QZ与罗氏阿太菌(Athelia rolfsii KT337414.1)有最大相似性，亲缘关系接近且同属一个遗传分枝 [37]。结合菌落形态特征与分子生物学分析，最终将菌株QZ鉴定为罗氏阿太菌，其无性态为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)。以上结果表明，引起荆州市花生白绢病的真菌为罗氏阿太菌。

Figure 2. PCR products of ITS for the pathogen. Note: 1, 2, 3 and 4 mean the ITS PCR products of southern blight

图2. 病原菌的ITS序列电泳图。注：1、2、3、4为白绢病菌的ITS PCR产物

Figure 3. Phylogenetic tree of the pathogen

图3. 病原菌系统发育树

4. 讨论

白绢病最早被叫做南方枯萎病，后来也有人将其叫做菌核性根腐病或菌核性苗枯病，是一种广泛发生的植物病害。在我国最早是由魏景超于1979年把白绢病病原菌的无性态归为小核菌属并将其叫做罗氏白绢小核菌，在同一年被戴芳澜称作齐整小核菌；其有性态被叫做罗氏阿太菌。自1891年美国弗罗里达州首次报道了番茄白绢病后，对各种植物白绢病的研究成为植物病害研究中的热点问题 [38]。2011年唐伟首次在加拿大一枝黄花白绢病上分离出齐整小核菌，且首次在国内作为生物除草剂而被研究报道 [39]。白绢病是一种全球性病害，寄主范围广泛，Weber在1931年首次整理纪录了齐整小核菌能够侵染的189种寄主植物，现已发现能侵染500多种寄主植物，新寄主还在陆续被研究报道 [39]。近些年来，花生白绢病的危害越来越严重，侵害范围越来越广，该病原菌适应性强，当处于不利环境时，菌核具有较强的抗逆性，可长期在土壤中存活，因此对该病害的研究是十分必要的。

传统形态学鉴定方法与基因组DNA序列分析相结合可以提高植物病原物种类鉴定的准确性，本文采用组织分离法分离出病原菌后，结合形态学观察和rDNA-ITS序列分析，将病株分离出的菌株QZ鉴定为罗氏阿太菌，明确了引起荆州市花生白绢病的病原菌。这不仅与李亮亮 [37] 等，傅俊范等 [40] 分离的河南和辽宁花生白绢病的病原菌相一致，也为后期对荆州市花生白绢病病原菌的生物学特性及药剂筛选等进一步的研究奠定基础，为病害预测及防治提供一定的思路，助力荆州市花生产业的良好发展。

参考文献

NOTES

^*共同第一作者。