优质稻金稻919成熟胚再生体系的建立

Establishment of Mature Embryo Regeneration System of Good Quality Rice Variety Jindao919

摘要: 以优质食味水稻品种金稻919成熟胚为外植体，设计4种激素配比诱导培养基和6种激素配比分化培养基，筛选最佳方案建立金稻919成熟胚再生体系。实验结果表明，Y2激素组合(4 mg/L 2,4-D)的诱导愈伤组织效果最佳，诱导率为77.3%；F5激素组合(4 mg/L 6-BA + 1 mg/L NAA)的分化成苗效果最佳，分化率为85.0%，成苗率为68.3%。本研究建立了金稻919成熟胚高效转基因再生体系，为利用基因工程技术定向改良奠定基础。

Abstract: The author used the mature embryo of good quality rice variety Jindao919 as explants, and established the regeneration system of Jindao919 mature embryo through screening four kinds of hormone combination induction medium and six kinds of hormone combination differentiation medium. The results showed that Y2 hormone combination (4 mg/L 2,4-D) had the best callus induction effect, with the highest calli induction rate of 77.3%; and F5 hormone combination (4 mg/L 6-BA + 1 mg/L NAA) had the best calli differentiation effect with the highest differentiation rate of 85.0% and the seedling formation rate of 68.3%. In this study, an efficient regeneration system of Jindao919 mature embryo was established, which laid a foundation for directional improvement by genetic engineering technology.

1. 引言

高效的水稻再生体系是进行水稻遗传转化的基础。自1965年Ameniya A H等对水稻组织培养开始研究以来，粳稻和籼稻的组织培养体系均日趋成熟。水稻的花粉粒、花药、幼胚均可作为外植体，且由于操作简单、诱导率高、愈伤组织质量好而被广泛用于水稻的遗传转化、品种培育中，但上述材料多受季节影响，取材不便且污染率高，现在人们更多地利用种子成熟胚作为外植体诱导高质量的愈伤组织。不同的水稻品种由于基因型差异，难以使用统一的水稻再生体系，需要摸索适合特定品种的诱导、分化、成苗激素组合 [1]。李玉静等研究表明，对日本晴而言使用2.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L 6-BA时愈伤诱导率最高，2.0 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L 6-BA时绿苗分化率和培养力最高 [2]。朱克明等认为水稻基因型对水稻愈伤组织的诱导和再生起决定性作用 [3]。沈秋萍等以籼稻9311为外植体，用2.5 mg/L 2,4-D诱导愈伤组织，2.5 mg/L KT + 0.1 mg/L NAA进行分化再生，效果最佳 [4]。

金稻919是粳型常规优质食味水稻品种，具有米质优良、出米率高、抗性全面、产量出色等优点，是天津小站稻的代表。为采用生物技术手段对金稻919进行改良，进一步提高其品质和抗性，其遗传转化及再生体系的建立尤为重要。因此为建立金稻919成熟胚再生体系，参考前人研究结果 [5] [6] [7] [8]，本实验设计4种激素配比不同的诱导培养基和6种激素配比不同的分化培养基，摸索最适合诱导和分化的激素组合，建立高效的金稻919成熟胚再生体系，为利用基因工程技术定向改良奠定技术基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料

本研究以天津市水稻研究所自主育成的金稻919成熟胚为外植体。所用的NB (货号N492)和MS (货号M519)培养基及激素均购自Phytotechnology。

2.2. 培养基

1) 愈伤组织诱导培养基4.1 g/L NB培养基 + 0.5 g/L L-脯氨酸 + 0.5 g/L谷氨酰胺 + 0.3 g/L水解酪蛋白 + 30 g/L蔗糖 + 3.5 g/L植物凝胶 + 不同激素组合(表1)，调节pH为5.8，121℃灭菌15 min，倒入90 mm培养皿，25 mL/皿，冷却凝固后可用。

Table 1. Hormone combination of callus induction medium

表1. 愈伤组织诱导培养基中的激素组合

2) 愈伤组织分化培养基4.43 g/L MS培养基 + 0.5 g/L L-脯氨酸 + 0.5 g/L谷氨酰胺 + 0.3 g/L水解酪蛋白 + 0.1 g/L肌醇 + 30 g/L山梨醇 + 30 g/L蔗糖 + 3.5 g/L植物凝胶 + 不同激素组合(表2)，调节pH为5.8，121℃灭菌15 min，倒入90 mm培养皿，25 mL/皿，冷却凝固后可用。

Table 2. Hormone combination of callus differentiation medium

表2. 愈伤组织分化培养基中的激素组合

3) 愈伤组织生根培养基2.215 g/L MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 3.5 g/L植物凝胶，调节pH为5.8，121℃灭菌15 min，倒入250 mL培养瓶中，冷却凝固后可用。

2.3. 方法步骤

1) 金稻919成熟胚愈伤组织诱导 将金稻919成熟种子(最好是当年新收获种子)剥离颖壳，取适量倒入50 ml离心管中，加入75%乙醇消毒1 min，倒掉乙醇，用无菌水洗涤1次；再加入30%次氯酸钠(有效氯3%)消毒20 min，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗5~6次；用移液枪吸去多余的水份，将成熟胚接种到诱导培养基中，置于28℃培养箱中，暗培养约8~12 d后，在水稻幼芽和成熟胚之间长出胚性愈伤组织，掐芽后放入新的诱导培养基上3~5 d后即可进行转化，若暂时不用就做继代培养，每15~20 d继代一次。每种激素组合接种10皿，每皿30粒。

$诱导率\left(\%\right)=出愈伤的成熟胚数量/总的成熟胚数量\times 100\%$

2) 不同激素组合对金稻919愈伤组织的分化培养 选取淡黄色、圆形、致密的愈伤组织转接在加入6种不同激素组合的分化培养基上中进行分化诱导，每种组合接8皿，每皿10块，培养条件为28℃，16 h光照/8 h黑暗培养。20 d~25 d统计分化率，35 d~40 d后统计成苗率。

$分化率\left(\%\right)=分化的愈伤组织数量/总愈伤组织数量\times 100\%$

$成苗率\left(\%\right)=分化的幼苗数量/分化愈伤组织数量\times 100\%$

3) 生根培养及驯化移栽 待分化出的幼苗长到2~3 cm左右，去除小苗根部的愈伤组织和培养基，转移到生根培养基上让幼苗长大，生根培养条件28℃，16 h光照/8 h黑暗培养。培养7~10 d后，幼苗长出大量的侧根，当小苗长至高约10~15 cm时，就可以打开盖子在室外炼苗2~3 d，取出小苗并小心洗去根部培养基，移栽至土中。

3. 结果与分析

3.1. 不同激素组合对诱导愈伤组织的影响

设计了4组不同激素比例的诱导培养基，金稻919在不同激素组合培养基中的诱导率和愈伤状态有差异。实验数据表明，Y2激素组合对愈伤组织的诱导率最高，最高达到77.3%，且愈伤组织状态最好；2,4-D浓度较高时，诱导率较高，Y2 (77.3%) > Y1 (66.0%)，Y4 (62.7%) > Y3 (54.0%)，Y2组合愈伤状态最佳，颜色淡黄，结构紧密，根毛少，芽短；2,4-D相同的条件下，添加6-BA后诱导率低于仅添加2,4-D的激素组合，即Y1 (66.0%) > Y3 (54.0%)，Y2 (77.3%) > Y4 (62.7%)，且愈伤状态不佳，根毛较多，芽长(表3和图1)。

Table 3. Effect of different hormone combination medium on callus induction rate

表3. 不同激素组合下愈伤组织诱导率的影响

Figure 1. Callus status induced for 10 days under different hormone combination medium

图1. 不同激素组合下诱导10 d愈伤组织状态

3.2. 不同激素组合对愈伤组织分化成苗的影响

设计了6种不同激素组合分化培养基，金稻919在不同的分化培养基中分化成苗差异明显。实验数据表明，同样浓度的KT和6-BA分化培养基中，6-BA的分化率和成苗率高于KT，即F1 > F4，F2 > F5，F3 > F6；分别对比KT和6-BA组内分化率和成苗率，发现其分化率和成苗率从高到低为F2 > F3 > F1，F5 > F6 > F4；综合比较6组实验数据，F5激素组合分化率和成苗率最高，分别达到85.0%和68.3% (表4和图2)；同时还发现随着KT和6-BA浓度的增加，其分化成苗的时间会逐渐缩短。

3.3. 金稻919成熟胚完整再生过程

从将金稻919成熟胚置于诱导培养基开始计算约需要10 d，继代5 d，分化再生培养约需要40 d，生根约8 d，整个再生过程共计约60 d完成(图3)。

Table 4. Effect of different hormone combination on callus differentiation rate and seedling rate

表4. 不同激素组合对愈伤组织分化率和成苗率的影响

Figure 2. Callus status after 30 days differentiation under different hormone combination

图2. 不同激素组合下分化30 d愈伤组织状态

(A) 诱导0 d；(B) 诱导10 d；(C) 继代5 d；(D) 分化15 d；(E) 分化30 d；(F) 生根7 d

Figure 3. Mature embryo regeneration system of Jindao919

图3. 金稻919成熟胚再生体系

4. 讨论与结论

植物再生体系应具有高效、稳定等特点。在水稻遗传转化研究中，以成熟胚为外植体具有取材方便、不受季节限制等优点，而材料基因型、培养基和外源激素的种类与浓度配比、培养条件等是影响愈伤组织形成和植株再生的主要因素；其中外源激素种类及浓度配比是愈伤组织分化再生的重要调控因子 [9] [10]。根据刘书梅等的研究结果，本研究直接采用了更适合粳稻种胚愈伤诱导的NB培养基 [11]。2,4-D是愈伤组织诱导形成的必要条件，与其它激素搭配使用后能改变诱导率的研究很多 [2]，本研究表明添加6-BA对2,4-D诱导愈伤组织没有明显的促进作用，甚至影响愈伤状态和降低诱导率。KT和6-BA是愈伤组织分化常用的细胞分裂素，袁云香 [12] 和周玲艳 [13] 等认为添加合适浓度的6-BA有利于水稻愈伤组织的分化，而沈秋平等 [4] 研究表明添加KT比6-BA的分化效果更好，而本研究结果表明在添加NAA的基础上，6-BA相比KT可以得到较高的分化率和成苗率。

综上，本研究选取金稻919成熟胚作为外植体，设计4种激素配比不同的诱导培养基，将金稻919成熟胚外植体接种在诱导培养基中诱导，观察愈伤状态并统计每组诱导率，得出最佳诱导激素组合为Y2激素组合(4 mg/L 2,4-D)，诱导率为77.3%；设计6种激素配比不同的分化培养基，将金稻919愈伤组织接种在分化培养基中进行分化培养，统计每组分化率和成苗率，得出最佳分化激素组合是F5激素组合(4 mg/L 6-BA + 1 mg/L NAA)，其分化率和成苗率分别是85%和68.3%；整个再生体系从诱导到幼苗再生共需要约60 d时间。金稻919成熟胚再生体系的建立，为利用基因工程技术定向改良奠定了技术基础。

基金项目

天津市重点研发项目(21YFSNSN00150)；天津市自然科学基金(19JCQNJC14000)；国家体系天津试验站(CARS-01-49)。

NOTES

^*共同第一作者。

^#通讯作者。