1. 引言
癌症作为人类健康的重大威胁之一，对人们的身心健康产生了重大影响。为了克服癌症带来的危害，人们采用各种方法对其进行研究探索 [1] [2] [3]。前药策略，因其能够显著提高化疗药物的药代能力、药学和药效特性，在癌症治疗中获得了更多的关注 [4] - [9]。尤其是将具有刺激响应性能的控制单元修饰到前药上，不仅能显著提高药物的载药效率，还能获得具有肿瘤微环境响应性能的前药系统，智能释放抗癌药物，实现癌细胞治疗效果 [10] [11] [12] [13] [14]。与正常的组织细胞不同，肿瘤组织具有独特的物理化学特性，比如肿瘤细胞内具有较高浓度的过氧化氢，这主要是由于细胞内氧化还原动态失衡，从而导致细胞出现氧化应激态，过度产生活性氧(ROS)，其浓度远高于正常细胞(约100倍)，高浓度的ROS会导致细胞的永久死亡 [7] [15]。值得注意的是，为了维持细胞内氧化还原的稳定，即使是癌细胞也会产生更多的谷胱甘肽(GSH，内源性三肽)作为抗氧化剂来清除活性氧以避免氧化失衡 [7] [15]。由于高浓度的ROS，癌细胞内的GSH浓度也相应的高出正常细胞7~10倍 [15]。此外，研究表明，GSH不仅参与癌细胞的分裂增殖，还对细胞的多种生物过程起到至关重要的作用，比如：外源性物质的解毒过程与细胞的周期进程 [7]。因此，利用癌细胞内高浓度的GSH设计具有GSH响应性能的调控单元在癌症治疗中具有潜在的应用价值。
喜树碱作为一种天然抗癌药物，其衍生物已被广泛应用于各种癌细胞治疗。10-羟基喜树碱(HCPT, 10-Hydroxycamptothecin)抗癌机制与喜树碱相似，被认为是喜树碱衍生物中抗癌效果最好之一，其主要通过抑制拓扑异构酶来缓解DNA的扭转 [7] [16]。由于HCPT具有很强的荧光发射能力，因此，我们认为基于HCPT构筑具有GSH响应机制的前药分子不仅能通过HCPT的GSH刺激响应性荧光指示肿瘤组织的位置，实时追踪药物释放过程，还能作为前药分子，显著提高载药效率，实现癌细胞的有效治疗。
为此，我们通过取代反应设计合成了具有GSH响应性能的HCPT前药分子(DNS-HCPT)。在前药分子DNS-HCPT中，2,4-二硝基苯磺酰基(DNS)通过取代反应与HCPT共价相连，且由于DNS的吸电子效应致使HCPT自身荧光发生猝灭，但是在高浓度的GSH作用下，DNS会发生分子内重排并从DNS-HCPT上脱离，将HCPT释放出来，此时的HCPT不仅能高效治疗肿瘤组织，还能通过自身的荧光实现肿瘤组织的定位与诊断。GSH刺激响应释放结果表明，DNS-HCPT前药分子不仅能有效释放前药HCPT用于治疗癌细胞，其GSH响应后的荧光变化还可用于追踪药物释放过程及肿瘤位置，在肿瘤治疗与诊断中具有潜在价值(图1)。
Figure 1. GSH responsive illustration of 10-hydroxycamptothecin prodrug (DNS-HCPT)
图1. 10-羟基喜树碱前药分子(DNS-HCPT)的GSH响应示意图
2. 实验部分
2.1. 试剂与仪器
10-羟基喜树碱(HCPT, 99%)、2,4-二硝基苯磺酰氯(DNS, 98%)，安耐吉化学；三乙胺(TEA)、碳酸氢钠、无水硫酸钠、二氯甲烷(DCM)、石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)，分析纯，南京化学试剂有限公司；薄层层析硅胶，300~400目，山东青岛海洋。
Bruker 400 MHz核磁共振仪，瑞士Bruker公司；Hitachi F-7000荧光光谱仪，日本日立公司；IKA RV 10旋转蒸发仪，德国IKA公司；WFH-203B暗箱台式三用紫外分析仪，上海精密仪器仪表有限公司。
2.2. 10-羟基喜树碱前药分子(DNS-HCPT)的合成
合成路线如图2所示：
Figure 2. Synthesis route of DNS-HCPT
图2. DNS-HCPT的合成路线
将10-羟基喜树碱(0.93 g, 2.55 mmol)溶解在100 mL的二氯甲烷中，加入0.8 g的三乙胺，冰浴降温20 min，接着将溶有2,4-二硝基苯磺酰氯(0.8 g, 3 mmol)的50 mL二氯甲烷恒压滴加至反应液中，滴加时间超过1.5 h，滴加结束，继续搅拌反应3 h。反应结束，反应液用饱和碳酸氢钠洗涤三次，收集有机相，用无水硫酸钠干燥过夜。过滤收集滤液，直接硅胶拌样，以石油醚/乙酸乙酯(v/v = 1:3)作为流动相，通过柱层析纯化得黄色固体产物DNS-HCPT (0.91 g, 1.53 mmol, 60%)。
2.3. 10-羟基喜树碱前药分子(DNS-HCPT)的核磁测试
在纯化得到目标产物DNS-HCPT后，以DMSO-d6作为溶剂，通过Bruker 400 MHz核磁共振仪对DNS-HCPT的氢谱、碳谱进行检测分析(图3和图4)，数据和图如下：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) δ (ppm): 9.16 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.58 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.66 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 1.86~1.81 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, 298 K) δ (ppm): 172.9, 157.2, 154.3, 152.1, 150.4, 148.7, 147.1, 147.0, 145.5, 134.2, 132.3, 132.3, 131.5, 131.0, 128.7, 128.0, 125.3, 121.7, 121.1, 120.1, 97.6, 72.8, 65.7, 50.7, 30.7, 8.2.
Figure 3. 1H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) of DNS-HCPT
图3. DNS-HCPT的氢谱(400 MHz, DMSO-d6, 298 K)
Figure 4. 13C NMR spectrum (100 MHz, DMSO-d6, 298 K) of DNS-HCPT
图4. DNS-HCPT的碳谱(100 MHz, DMSO-d6, 298 K)
3. 结果与讨论
3.1. DNS-HCPT的GSH刺激响应性研究
根据相关文献报道 [17] [18]，前药分子DNS-HCPT中的2,4-二硝基苯磺酰基(DNS)部分对GSH具有显著的刺激响应性，可以使DNS-HCPT中的DNS重排离去，接下来首先对DNS-HCPT的GSH刺激响应性进行研究。
首先，配制0.2 mM的DNS-HCPT水溶液(含少量DMSO助溶)，通过荧光光谱检测发现几乎没有荧光信号，此时在365 nm激发下也观察不到任何荧光，说明此时前药分子DNS-HCPT非常稳定，HCPT不能被释放出来(图5和图6)。然而，当向DNS-HCPT溶液中加入0.2 mM的GSH溶液后，1 min后可以检测到荧光强度为828 (545 nm处)，说明HCPT被释放出来了，并且随着时间的增加，荧光强度越来越强，8 min后甚至可以达到2288 (545 nm处)，说明前药分子DNS-HCPT具有明显的GSH刺激响应性(图5)。
更为重要的是，通过8 min的GSH刺激响应释放，我们可以观察到显著的黄色荧光，说明大部分前药HCPT被释放出来了，相较于GSH刺激响应释放前，荧光强度足足提高了48倍(图6)。上述荧光实验表明前药分子DNS-HCPT不仅具有显著的GSH刺激响应性能，其释放的前药分子HCPT还能够被用于追踪识别肿瘤组织的高浓度GSH环境，同时对癌细胞进行治疗，在肿瘤的诊治结合中具有潜在的价值。
Figure 5. Fluorescence spectra of DNS-HCPT (0.2 mM) with GSH (0.2 mM) in different time
图5. DNS-HCPT (0.2 mM)在GSH (0.2 mM)作用下不同时间段的荧光图谱
Figure 6. Fluorescence spectra of DNS-HCPT (0.2 mM) with 0.0 and 0.2 mM GSH
图6. DNS-HCPT (0.2 mM)在0.0和0.2 mM GSH作用下的荧光谱图
3.2. DNS-HCPT的释放研究
在确定前药分子DNS-HCPT的GSH刺激响应性能后，接着对DNS-HCPT (0.2 mM)的GSH刺激响应释放进行了深入研究。如图7所示，在没有GSH的情况下，前药分子DNS-HCPT能够一直保持稳定，几乎没有任何的HCPT荧光信号能够被检测到。然而，当加入0.1 mM的GSH后，可以发现HCPT的荧光信号显著增强，随着时间的增加逐渐达到平衡，说明DNS-HCPT在GSH的作用下成功地释放出了前药分子HCPT。值得注意的是，随着GSH浓度从0.1 mM增加到0.2 mM和0.5 mM，HCPT的释放量也显著地从48%增加到了80%和90%，说明该前药分子具有很好的GSH刺激响应性能。这些释放结果说明，DNS-HCPT不仅具有显著的GSH刺激响应性能，在高浓度GSH下还能高效地释放前药分子HCPT，在癌细胞的诊治中具有重要价值。
Figure 7. Time-dependent HCPT release at different GSH concentrations
图7. DNS-HCPT (0.2 mM)在不同GSH浓度下的释放曲线
3.3. DNS-HCPT的释放机理研究
谷胱甘肽(GSH)是一种谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的含有巯基的三肽(R-SH)。文献表明 [5] [7] [8]，当加入GSH后，R-SH中的巯基会进攻DNS，发生取代反应，同时DNS中的磺酰基会进行重排，最终以SO2的形式离去，而GSH通过巯基最终被修饰到磺酰基的位置，从而把前药HCPT给释放出来，实现GSH的刺激响应释放(图8)。
Figure 8. GSH release mechanism of DNS-HCPT
图8. DNS-HCPT的GSH释放机理
4. 结论
我们以10-羟基喜树碱(HCPT, 10-Hydroxycamptothecin)作为前药分子，通过取代反应在HCPT的10-羟基位置成功修饰了2,4-二硝基苯磺酰基(DNS)，得到了具有诊治结合功能的喜树碱前药分子(DNS-HCPT)。由于DNS的分子内抑制作用，前药分子DNS-HCPT不发射荧光，但是在谷胱甘肽(GSH)的作用下，DNS-HCPT不仅能将前药分子HCPT快速地释放出来，其释放的HCPT还能发射出很强的黄色荧光，这样显著的荧光变化可被用于肿瘤组织的追踪与识别。更为重要的是，HCPT作为喜树碱衍生物中抗癌效果最好之一，DNS-HCPT释放的HCPT还能被用于癌细胞的治疗。因此，该前药分子DNS-HCPT在癌细胞的诊断与治疗中具有潜在的应用价值。
基金项目
本项目由国家自然科学基金(No. 22075152)支持。
NOTES
*通讯作者。