基于网络药理学和分子对接法探讨黄芪治疗前列腺癌的机制

Exploring the Mechanism of Astragalus membranaceus in the Treatment of Prostate Cancer Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

摘要: 运用网络药理学与分子对接探索黄芪治疗前列腺癌的作用机制。方法：通过借助中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)筛选黄芪的成分及作用靶点，使用OMIM和GeneCards数据库筛选HT靶点；采用Cytoscape软件构建化学成分–潜在靶点网络图和蛋白相互作用网络图，进而筛选出关键靶点，借助DAVID数据库对靶点进行GO分析和KEGG通路分析；使用AutoDock Vina进行分子对接，初步筛选并进一步验证黄芪中的核心化学成分。结果：从黄芪中得到16个活性化合物及；筛选出与前列腺癌相关作用靶点172个；黄芪可以通过调节AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等对前列腺癌发挥治疗作用。其中CCND1、MYC、MAPK1、AKT1、ESR1、TNF、RELA、TP53、RB1、IL6、JUN、FOS、MAPK14等基因可能为关键靶点；分子对接结果显示：槲皮素与FOS蛋白的亲和力较好。结论：黄芪治疗前列腺癌的潜在作用机制具有多成分–多靶点–多通路的特点，为阐述黄芪治疗前列腺癌的作用机制和开展进一步研究提供依据。

Abstract: Objective: Using network pharmacology and molecular docking to explore the mechanism of Astragalus membranaceus in the treatment of prostate cancer. Methods: The components and action targets of Astragalus membranaceus were screened by the pharmacological database and analysis platform (TCMSP), and the HT targets were screened by OMIM and GeneCards database. Cytoscape software was used to construct the chemical components-potential target network and protein in-teraction network, and then the key targets were screened out. The GO analysis and KEGG pathway analysis of the targets were performed with the help of DAVID database. AutoDock Vina was used for molecular docking to preliminarily screen and further to verify the core chemical components in Astragalus membranaceus. Results: Sixteen active compounds were obtained from Astragalus membranaceus. 172 targets related to prostate cancer were screened out. Astragalus membranus can play a therapeutic role in prostate cancer by regulating AGE-RAGE signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, IL-17 signaling pathway, MAPK signaling pathway, tumor necrosis factor signal-ing pathway, etc. Among them, CCND1, MYC, MAPK1, Akt1, ESR1, TNF, RELA, TP53, RB1, IL6, Jun, FOS, MAPK14 and other genes may be key targets. The results of molecular docking showed that quercetin had a good affinity with FOS protein. Conclusion: The potential mechanism of Astragalus membranaceus in the treatment of prostate cancer has the characteristics of multi-component, mul-ti-target and multi-pathway, which provides the basis for further study on the mechanism of Astragalus membranaceus in the treatment of prostate cancer.

1. 引言

前列腺癌(Prostate cancer, PCa)已成为男性泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，也在男性癌症患者死亡原因中排名第二 [1]。早期前列腺癌患者缺乏特异的临床症状，一般较隐匿，临床上主要表现为尿频，尿急、夜尿增多、尿流细弱等症状并与前列腺增生临床症状类似；当出现明显的症状时，疾病多发展至中晚期 [2]。由于前列腺癌属于激素内分泌性疾病，雄激素受体在前列腺癌发生中有重要作用，因此雄激素剥夺疗法是临床前列腺癌治疗常见方式 [3] [4]。然而被称为“隐秘的杀手”的前列腺癌临床极易发生骨转移，多数患者初诊时即失去了根治性治疗的机会 [5]。目前西医以内分泌治疗为主，发展为去势抵抗性前列腺癌的中位时间约为14~30个月 [6]。祖国医学从整体观念和辨证论治出发，针对前列腺癌的不同阶段采取不同治则，如局限期以扶正抗癌、整体调节为主，局部晚期以增效减毒、稳定病灶为主，转移性PCa以抑制转移、延长激素敏感时间为主，去势抵抗性PCa则以延长生存时间、提高生活质量为主。目前多项临床试验表明中医药在前列腺癌治疗中不仅能提高患者生活质量、减少药物不良反应，同时可延缓疾病的进展，延长患者的生存时间 [7] [8] [9]。因此，传统中医药已成为当下前列腺癌的研究热点 [10]。

前列腺癌的病程较长，通过病例–对照研究方法回顾性分析发现中医证型多表现为脾肾亏虚型 [11]。通过流行病学临床调查研究方法，通过对214例前列腺癌患者的中医体质特点进行统计分析发现，气虚质为前列腺癌患者最主要的中医体质 [12]，患者主要表现为神疲乏力、气短懒言、腹胀纳呆，舌苔多见薄白腻，脉多细滑，病情严重者可出现颜面及四肢浮肿、精神萎靡、嗜睡、记忆力减退等症状，提示本病的主要病机气虚湿困，以脾虚为本 [13]。《本草纲目》言：“脾胃一虚，肺气先绝，必用黄芪温分肉、益皮毛、实腠理，不令汗出，以益元气而补三焦。”黄芪味甘，气微温，归肺、脾经，功效为补气、祛湿消肿，故与黄芪辨治前列腺癌药证相契合。研究显示，中药黄芪的内含活性物质作用于人体的先天免疫和特异性免疫，起到抗病毒、抗衰老、抗肿瘤等多种生物功能而被广泛关注 [14] [15]。结合本实验组的前期对“健脾利湿化瘀法”治疗中晚期前列腺癌内分泌治疗后部分雄激素缺乏综合征的临床实验观察研究显示可有效减缓疾病进展，改善临床症状，降低肿瘤标志物水平，减轻内分泌治疗相关的不良反应 [16]，但其确切机制尚未完全阐明。

近年来，网络药理学因其系统性和整体性的特点被广泛用于筛选中药有效成分、阐释作用机制和揭示方剂配伍原理为复杂中药体系的研究提供了新思路 [17]。而分子对接方法作为计算机辅助药物分子设计中的一类主要方法，已被广泛应用于中草药药效作用与机制探索 [18]。本研究以网络药理学和分子对接技术为基础，探索黄芪治疗前列腺癌的可能药效机制，旨在为黄芪的临床应用及前列腺癌的防治研究提供新思路。

2. 治疗与方法

2.1. 化学成分的收集与筛选

采用TCMSP [19] (中药系统药理学数据库和分析平台https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索出黄芪成分的数据，通过药物动力学参数口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%和药物相似性(drug-like properties, DL) ≥ 0.18进行筛选 [20] [21]。

2.2. 潜在靶点的预测

利用TCMSP数据库对药物成分的检索和整理，获得黄芪活性化合物作用靶点。在GeneCards (人类基因综合数据库，http://www.genecards.org/)和OMIM (人类孟德尔遗传数据库，https://omim.org)和PharmGkb (药物基因组学知识库，https://www.pharmgkb.org/)和TTD (疗效药靶数据库http://db.idrblab.net/ttd/)和DrugBank (生物信息学和化学信息学数据库https://www.drugbank.ca/)中输入关键词Prostate cancer，查找收集已有研究的前列腺癌相关蛋白，限定物种为人，输入到Uniprot (蛋白数据库，https://www.UniProt.org)中，将其转化为与蛋白相对应的编码基因。

2.3. “中药–化学成分–靶点”网络构建与分析

运用R语言VennDiagram包筛选出黄芪和前列腺癌的共同作用靶点，并得到靶点所对应的所有化学成分，将筛选出来的数据导入Cytoscape Version 3.7.2 (生物信息分析软件，https://cytoscape.org/)，绘制“中药–化学成分–潜在靶点”网络图。

2.4. 蛋白互作(PPI)网络分析

利用String (蛋白互作网络分析数据库，https://string-db.org/)构建蛋白互作网络图(protein protein interaction network, PPI network)，限定物种为人，借助cytoHubba插件计算节点间相互作用程度数值(degree, DC)并统计分析。

2.5. 靶点的通路分析

将黄芪作用于前列腺癌的潜在靶点导入DAVID (生物学信息注释数据库，https://david.ncifcrf.gov/)，进行GO (基因本体，http://geneontology.org/)和KEGG (京都基因与基因组百科全书，https://www.kegg.jp/)通路富集分析，保存结果。并按照涉及的靶点数目多少进行排序，筛选排名靠前的生物过程或通路，用Barplot绘制条形图。

2.6. 分子对接

采用ChemBioDraw Ultra 14.0画出筛选得到化学成分的结构，同时转化为三维结构，并使用MMFF94 力场进行优化。相应关键靶点蛋白的三维结构从RCSB Protein Data Bank (http://www1.rcsb.org/)下载得到，并作为分子对接所用的蛋白。小分子化合物均使用AutodockTools 1.5.6 (分子对接软件，http://vina.scripps.edu/)转化为PDBQT格式。采用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接研究。根据原配体的位置，确定了这几个蛋白的活性位点，为了增加计算的准确度，将参数exhaustiveness设置为40。除了特别说明，其他参数均采用默认值。通过分子对接得到11种活性成分与5种蛋白的结合能数值后，将数据导入Graphpad 8.0绘制黄芪中化学成分分子对接结果。选取打分值最高的构象用Free Maestro 11.9进行结果分析。

3. 结果

3.1. 化学成分的收集与筛选

本研究通过TCMSP数据库和相关文献查阅，共检索到黄芪所有成分20个见表1。

Table 1. Basic information of some active ingredients in Astragalus membranaceus

表1. 黄芪成分中部分有效成分的基本信息

注：OB为生物利用度，DL为药物相似性。

3.2. 潜在靶点的预测

利用TCMSP作为靶点预测模型，获得上述成分的作用靶点953个。通过OMIM数据库、TTD数据库、PharmGkb数据库、DrugBank数据库检索，获得前列腺癌疾病相关靶点，删除重复靶点，共得到列腺癌疾病靶点12,279个，将所得靶点信息进行基因名标准化并见图1。

Figure 1. Matching of disease target genes with drug target genes

图1. 疾病靶点基因与药物靶点基因的匹配

3.3. “中药–化学成分–潜在靶点”网络结构分析

通过将黄芪活性化合物与前列腺癌疾病靶点进行映射找交集，去除与前列腺癌疾病靶点无关的活性化合物，选出共同的疾病靶点，最终得到16个活性化合物及与其相对应的172个疾病靶点。采用Cytoscape 软件构建“中药–化学成分–靶点”网络模型。该网络有188个节点(包括1个中药、16个成分、172个靶点和1个疾病)和179条边。其中红色表示黄芪主要成分，绿色方块表示成分对应前列腺癌治疗的相关靶点。充分说明中药黄芪具有多成分、多靶点、多通路共同作用对前列腺癌疾病达到治疗目的并见图2。

Figure 2. “Astragalus-chemical composition-potential target” network diagram

图2. “黄芪–化学成分–潜在靶点”网络图

3.4. 蛋白互作用网络分析

PPI网络中共含有636个节点，网络中全部节点按照DC值大小由内向外来呈现。将网络蛋白互作网络全部节点，导入Cytoscape进行分析，借助CytoNCA插件对Betweenness、Closeness、Degree打分进行统计计算。最终筛选出前13个关键靶点蛋白，分别是CCND1、MYC、MAPK1、AKT1、ESR1、TNF、RELA、TP53、RB1、IL6、JUN、FOS、MAPK14，表明这13个核心靶点在前列腺癌疾病发生中有重要作用，所有蛋白之间的相互作用关系见图3。

Figure 3. Protein-protein interaction network

图3. 蛋白–蛋白互作网络

3.5. 靶点的通路分析

将筛选得到的172个相关靶点进行GO分析和KEGG通路分析。结果见图4和图5。GO富集分析包括生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组分(cellular component, CC) 3个成分，共富集到172个生物过程和2638条相关通路(P < 0.05)，筛选排列靠前的生物过程依次为细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、对药物的反应(response to drug)、氧化应激反应(response to oxidative stress)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)；相关富集通路主要涉及PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)及晚期糖基化终产物受体与配体晚期糖基化终产物在糖尿病并发症中的信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)。

Figure 4. GO enrichment analysis of astragalus components in treating prostate cancer targets

图4. 黄芪成分治疗前列腺癌靶点的GO富集分析

Figure 5. KEGG pathway analysis of Astragalus membranaceus in the treatment of prostate cancer

图5. 黄芪成分治疗前列腺癌靶点的KEGG通路分析

3.6. 分子对接分析

通过对化合物的不同靶蛋白亲和力分析，获得相关亲和力数据如表2，确定靶蛋白的活性位点三位坐标中心，计算得到所有结合能数值后绘制分子热图。亲和力 < −5认为有较好的结合活性，亲和力 < −7则具有强烈的结合活性。一般认为配体与受体结合能越低，构象就越稳定，发生作用的可能性也就越大。TP53、CCND1、FOS、TNF、AKT1、ESR1、JUN分别与槲皮素(Quercetin)山柰酚(kaempferol)、异黄烷酮(isorhamnetin)、芒柄花素(formononetin)有较好的结合活性并筛选亲和力较强的靶蛋白和化合物并对接至关键蛋白的活性位点如图6。

Table 2. Heat map of molecular docking results of Astragalus membranaceus

表2. 黄芪化学成分分子对接结果热图

Figure 6. Molecular docking diagram

图6. 分子对接示意图

4. 讨论

近年来，全球男性发病率最高的前列腺癌 [22] 对于男性健康危害越来越大而逐渐被重视。通过对中医诊治前列腺癌的证候分型和辨证方药规律总结研究发现，前列腺癌的发生发展与正邪变化密切相关，扶正法在临床上被广泛应用 [23]；文献报道也显示中医扶正抑瘤法在临床治疗晚期前列腺癌取得不错的临床获益 [24]，但目前对于前列腺癌发生机制尚不明确，主要与雄激素受体(AR)的基因扩增、突变、配体非依赖性激活等有关 [20]；越来越多的关于前列腺肿瘤病因学及发病机制研究表明，基因异常在前列腺癌的发生、发展过程中起着重要的作用，常见的相关基因包括遗传易感性基因、肿瘤抑制基因、转移基因、转移抑制基因等 [25]；主要的研究通路集中于PI3K-AKT-m TOR/FOXO/NF-κB等信号通路 [26]。黄芪作为常用的扶正中药，广泛地应用于前列腺癌中医药治疗的临床实践中，黄芪多糖、黄芪注射液在联合化疗治疗前列腺癌也得到了广泛使用。目前大量研究显示黄芪及其制剂对于抑制前列腺癌细胞调节患者机体免疫功能、降低放化疗毒副作用、改善患者预后有着显著作用。

本研究基于网络药理学技术筛选得到的16种成分中除常春藤皂苷元属于皂苷类，其余均为黄酮类，分子对接技术得到最核心的4个成分为槲皮素、山柰酚、异黄烷酮和芒柄花素。于玲 [27] 认为黄芪中的黄酮类成分有明显的抗癌作用，郑雪花 [28] 通过实验研究发现黄酮类化合物对去势抵抗性前列腺癌靶标AKR1C3的活性具有较强的抑制作用；邢红宇 [29] 等通过相关细胞实验发现了槲皮素可有效减弱肿瘤细胞启动子甲基化程度，抑制LNCap细胞的生长增殖、通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导PC-3细胞发生自噬 [30]；王康静 [31] 等通过槲皮素对人前列腺癌PC3裸鼠移植瘤的实验性疗效研究也证实了槲皮素对肿瘤细胞的抑制作用；通过机制层面研究证明了槲皮素对于前列腺癌的治疗应用依据。仇炜 [32] 等通过应用损伤愈合实验检测山柰酚对PC-3细胞迁移的作用，结果显示出山柰酚抑制PC-3细胞迁移。谭蓓蓓 [33] 等通过18F-氟化钠PET CT法研究山柰酚对前列腺癌骨转移模型小鼠的作用及其机制实验，结果显示山柰酚可通过调节丝裂原活化蛋白激酶和胞外信号调节激酶以及肿瘤坏死因子-α的表达，发挥抗前列腺癌肿瘤生长的作用。通过机制层面研究证明了山柰酚对于前列腺癌的治疗应用依据。研究显示芒柄花素作为抗肿瘤药物可用于治疗多种类型的肿瘤包括前列腺癌 [34] [35]，其发挥抗肿瘤作用的机制主要包括通过多种分子途径抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭及诱导细胞周期停滞等。结合相关基础实验和临床疗效观察，也为黄芪成分的进一步筛选和深入分析研究提供了重要参考。

分析结果显示，CCND1、MYC、MAPK1、AKT1、ESR1、TNF、RELA、TP53、RB1、IL6、JUN、FOS、MAPK14这13个核心靶点在网络图中起主要作用。CCND1 (Cyclin D1)作用在于作为细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs的调控者。不同的周期蛋白表现出各自独特的表达及降解特性，这有助于每个有丝分裂事件在时间上的协调性，PCa组织中Cyclin D1表达增高，其异常表达与PCa的发生发展有关 [36]。N-Myc为NEPC驱动基因，可促进前列腺癌的神经内分泌转化，且高表达N-Myc的患者生存率普遍较低，靶向N-Myc相关信号通路可以为治疗前列腺癌提供新的方向和思路 [37]。胡波 [38] 利用microRNA-212通过调控MAPK1，抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭，从而促进前列腺癌细胞凋亡，证明了MAPK1靶点对于前列腺癌治疗的研究意义。张丽娟 [39] 通过敲除AKT1基因，裸鼠皮下接种成瘤实验结果发现皮下成瘤能力明显减弱，证实了AKT1基因在去势抵抗性前列腺癌进展中的重要作用。赵谊宁 [40] 通过对前列腺腺癌标本癌组织和前列腺增生的免疫组化指标统计发现ESR1在良性前列腺增生组织中低表达，而在前列腺癌组织中呈现高表达，其表达有显著性差异，也提示ESR1作为前列腺癌治疗的对应靶点。袁佳璐 [41] 通过研究RB1基因表达对前列腺癌LNCaP细胞系生物学行为及药物敏感性的影响发现，RB1基因表达状态可影响LNCa P细胞系功能，RB1基因表达状态有可能成为前列腺癌内分泌药物疗效的预测因子。IL-6在短期促进PC3细胞的增殖，并且诱导miR-21的高表达同时miR-21与前列腺癌的恶性程度及依赖性相关，在前列腺癌的非依赖性进程中起重要作用，因此IL-6通过调节miR-21的增殖成为非依赖性前列腺癌的一个潜在治疗靶点 [42]。JNK激活后，可以通过下游底物调控细胞增殖、存活、分化和代谢，在多种癌症的发生发展中发挥重要作用 [43]。早期研究 [44] [45] [46] 结果显示：多种癌基因，如Ras、Bcr-Abl、Met和c-Fos传递的癌基因信号依赖JNK的激活，表明JNK信号参与癌基因信号传导促进癌症进展。

KEGG通路富集分析结果表明，黄芪治疗前列腺癌的关键靶点主要富集于AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)等。Wu Xiaoming等 [47] 发现PI3K-Akt信号通路能够调控多种蛋白质的合成，参与了前列腺癌细胞的增殖和凋亡、迁移与分化等多种调节。早期前列腺癌患者经过去势治疗，往往都会发展至去势抵抗性前列腺癌，研究发现长期的ADT治疗会促进PI3K/Akt通路的激活，从而增加了肿瘤细胞的抗凋亡能力 [48] 这些发现也为PI3K/AKT信号通路上出现新的治疗靶点提供了研究可能 [49]。包继明等 [50] 研究发现，在前列腺癌细胞中，AGE与其受体RAGE结合后，激活了PI3K/Akt信号通路，RB蛋白磷酸化显著增强，磷酸化的RB总量明显升高，磷酸化的RB可能释放出与之结合的转录因子E2F，E2F启动转录，细胞周期从G1进展至S期，从而促进了前列腺癌细胞增殖。目前多个研究层面已证实，脂代谢重编程在肿瘤领域受到广泛重视，并被认为在CRPC细胞的增殖、凋亡、迁移侵袭和维持膜稳态等多种生物学过程中发挥重要作用，还参与调控机体肿瘤免疫、耐药和内环境稳态等多种过程 [51]。PCa发生发展过程中存在多种途径的脂代谢异常，包括循环池中脂质的摄取增加 [52]，脂肪酸从基质脂肪细胞更多地转移到PCa细胞内 [53]；有数据统计显示PCa患者在接受ADT治疗12~24周后，可观察到患者胰岛素抵抗增强和血清胆固醇升高的现象 [54]。通过对临床病例统计分析发现，与良性前列腺增生组织相比，前列腺癌患者中IL-17水平明显升高 [55]，IL-17可能通过促进肿瘤血管形成参与前列腺癌的发生、发展 [56]。陈海蛟等 [57] 实验发现MAPK信号通路可促进PC-3细胞的黏附、迁移和侵袭能力。

本研究结果显示，中药黄芪主要以16种成分作用于172个疾病相关靶点，核心成分为槲皮素、山柰酚、异黄烷酮、芒柄花素，涉及多种生物过程、分子机制和通路调控，体现了黄芪多成分、多靶点、多途径的作用特点，重要靶点与核心通路之间达到了密切而统一的联系。通过查阅国内外相关文献对核心通路的分析与验证，对黄芪治疗前列腺癌的具体机制和核心通路有了初步掌握，但分子对接结果与真实环境可能存在一定的差异，后期还需要对相关靶点开展针对性动物实验研究进行验证。

NOTES

^*通讯作者。