1. 引言
由天冬氨酸转氨酶转化苯丙酮酸(PPA)是制备L-苯丙氨酸(L-Phe)的一条重要工艺路线 [1] [2]，稳定高产天冬氨酸转氨酶的菌株是该工艺的基础 [3]。本实验室利用分子生物学手段构建了一株组成型表达天冬氨酸转氨酶的工程菌BL21/pET-aspC，具有较高活力。但该菌株因工业化需求构建为组成型表达体系，导致菌体生长与外源基因高效表达相互干扰，发酵过程中质粒不稳定易于丢失，为该重组菌的工业化生产带来很大困扰 [4]。基因工程菌在生长过程中由于外源基因的表达带来的压力会导致的生长缓慢，以及遗传不稳定性。实验室通常采用诱导型表达体系将重组菌生长与表达分离，降低外源基因在重组菌生长阶段的表达量，减轻宿主生长的压力 [5] [6]。但诱导表达体系往往需要添加IPTG或乳糖等昂贵的诱导剂，难以适应工业化的需求 [7] [8]。组成型表达体系无需诱导，免去了诱导剂，也排除了诱导剂对菌体生长的抑制作用，在工业生产方面具有较强的优势，但外源基因伴随菌体生长时外源蛋白的表达会带来质粒丢失、包涵体过多是该体系的缺点 [9] [10]。质粒的稳定性遗传受到宿主和质粒的基因型、比生长速率、基因的表达程度、培养温度、营养限制和反应器操作方式等多种遗传和环境因素的影响。培养基组成，细菌比生长速率等对外源基因的稳定性、表达及菌体生长尤为重要 [9]。因此确立基因工程菌高效稳定的培养体系是相关高效工程菌产业化的关键 [11]。
本研究采用自行构建的天冬氨酸转氨酶基因工程菌，通过对发酵条件与工程菌质粒稳定性、高效表达的相关因素的研究，得到以淀粉、玉米浆、柠檬酸铵为主要营养物的发酵体系，完全突破了常规基因工程菌LB培养基的框架，其发酵成本约为LB培养基的1/10，而且工程菌的质粒稳定性及目的蛋白的表达同时有显著提高，为该工程菌的产业化奠定了基础。
2. 实验
2.1. 菌株
重组菌BL21-pET/aspC由本研究室构建；
2.2. 培养方法
由平板接种重组菌至液体培养基(加Amp 100 µg/ml)中，37℃，180 rpm培养至菌种对数生长期末期，再以3%接种量接种至发酵培养基(加Amp 100 µg/ml)中，37℃，180 rpm培养。
2.3. 发酵条件优化方法
2.3.1. 不同碳氮源、金属离子与生长因子对重组菌比酶活的影响
以淀粉为碳源，10 g/L NaCL为无机盐，添加2 g/L酵母膏为氮源及生长因子。培养基中添加各种碳源、氮源、无机盐与辅因子，(实验中添加玉米浆固型物含量为20%左右，添加量参照以固形物质量计算)，分别测定发酵不同时间段发酵液天冬氨酸转氨酶比酶活，选取最高点比较。
2.3.2. 正交实验
根据1.2.6~1.2.7实验选择对重组菌生长及产酶有影响的三个因素并确定添加量，根据正交实验表设计实验方案，进行正交实验。数据分析采用通过L9(33)及3水平3因素正交表进行，做9组实验提取数据
2.4. 分析方法
2.4.1. PPA和L-Phe的检测
采用高压液相色普(HPLC)检测，C18的反相柱，流动相：0.01 M的醋酸钠(pH 4.5)，0.4 mM的醋酸铜，22%的甲醇。流速：0.3 mL/min，检测波长：230 nm。
2.4.2. 天冬氨酸转氨酶比酶活测定方法
取1 ml发酵液。加入1 ml底物(PPA 0.1 mol/L，L-Asp 0.11 mol/L，氨水调pH 8.5)，37℃反应1 h，采用三价铁离子法检测PPA含量，以PPA的减少量折算成转氨酶比活力。
2.4.3. 质粒稳定性检测
取发酵液，稀释至一定倍数，分别取稀释后菌液100 μL涂布于添加Amp 100 µg/ml的LB固体培养基和不添加Amp的LB固体培养基，37℃培养16小时后计单菌落数量，以添加Amp的培养基菌落数(具有Amp抗性)和总菌落数计算质粒稳定性。
质粒稳定性 = 具有Amp抗性菌落数/总菌落数(%)
3. 结果与讨论
3.1. 重组菌发酵条件优化
表1和图1、图2分别考察了碳氮源和金属离子等生长因子对重组菌比酶活的影响。实验中添加玉米浆固型物含量为20%左右，添加量以固形物质量计算。其中淀粉作为碳源，玉米浆和柠檬酸氨为氮源添加后重组菌转氨酶比酶活有显著提高。金属离子和生长因子中Fe2＋的添加虽然促进菌体生长，但不利于天冬氨酸转氨酶的表达，其他物质对菌体生长及天冬氨酸转氨酶比酶活无显著影响。
Table 1. Effect of assistant factors on the AspAT enzyme activity and biomass of recombinant E. coli
表1. 金属离子和生长因子对重组菌产转氨酶和生长的影响
Figure 1. Effect of nitrogen source on the AspAT enzyme activity of recombinant E. coli
图1. 氮源对重组菌产转氨酶的影响
Figure 2. Effect of carbon source on the AspAT enzyme activity of recombinant E. coli
图2. 碳源对重组菌产转氨酶的影响
选择对重组菌生长及产酶有影响的三个因素：A：玉米浆；B：淀粉；C：柠檬酸氨进行正交实验，并对测定的数据进行分析，数据见表2。
正交实验数据分析：通过对比实验数据和极差分析，在这三种因素中，对转氨酶酶活性影响为：玉米浆(56.5) > 淀粉(13.0) > 柠檬酸氨(5.1)。因子A去3水平最佳，B取2水平最佳，C取2水平最佳，各因素的最优水平为A3B2C2。由于正交实验所确定的最佳条件并未被包含在正交表的九个实验中，因此按最佳条件进行了验证。同时，做一个A3B2C3为对照，比酶活分别为：A2B2C3：165；A3B2C2：184。验证实验的产酶量处于正交实验的最高水平，实验结果与理论推导一致。优化最终培养基为：玉米浆45 ml/L；淀粉2 g/L；柠檬酸氨1 g/L。该培养基本研究简称为CSN培养基。
Table 2. Selecting the best medium using three level orthogonal
表2. 三水平正交实验表优化最适培养基
3.2. CSN培养基对菌体生长和外源基因表达及稳定性的影响
对比原培养体系，重组菌BL21/pET-aspC菌体生长及天冬氨酸转氨酶比酶活均有显著提高(数据见图3)。
Figure 3. Effect of CSN on the Growth and the expression of AspAT enzyme of recombinant E. coli
图3. CSN培养基对重组菌生长和外源基因表达的影响
培养基优化后，重组菌迟滞期明显减少，较快进入对数生长期，并在10 h进入稳定期，天冬氨酸转氨酶比酶活随菌体的生长表达量迅速增加，在8 h，先于菌体生长达到稳定期。在菌体稳定期的后期，新的培养体系菌体生物量和比酶活均有有明显下降，原培养体系则稳定期较长，可能是由于菌体前期生长过于旺盛，菌体更易于进入消亡期所致。两个体系发酵过程中高比酶活区间均较宽，对于下一步利用转氨酶转化制备L-Phe过程中菌体的收集非常有利。
本研究为两级发酵，因此培养基对外源基因稳定性，尤其是种液中外源基因稳定性的影响至关重要，实验优化后培养基CSN与原出发菌使用培养基LB 成份改变较大，所以本研究考察了两种培养基对外源基因稳定性的影响，见图4。菌体生长初期，因培养基中含有100 µg/ml Amp两种培养基中重组菌质粒丢失率均较低，随培养时间的增长，培养基中Amp的消耗，施加的选择性压力降低，LB培养基中重组菌质粒丢失率迅速增加，而CSN培养基质粒丢失率相对较低，表明重组菌外源基因的稳定性在CSN培养基中有了显著提高。
Figure 4. Effect of various medium on the plasmid of recombinant E. coli
图4. 培养基对外源基因稳定性的影响
3.3. CSN培养基中各组份对重组菌的影响分析
玉米浆的添加(图5)对重组菌影响较大，随着培养基中玉米浆含量的增加菌体生物量快速增加，对比淀粉(图6)的添加对重组菌的生长无明显影响，柠檬酸氨(图7)单组份对菌体生长的影响表现为在生长前期菌体生长较快，后期生物量则有所下降。表明该培养基主要营养物质为玉米浆。而且玉米浆可明显改善质粒稳定性，可能是玉米浆中含有大量的有机质，同时含有丰富的无机盐，金属离子，氨基酸等，不仅可作为碳氮源供菌体生长所需，更能提供大量的菌体生长所需生长因子，利于重组菌的质粒稳定性。淀粉的添加同样可改善质粒的稳定性，有报道培养基中少量添加葡萄糖可改善质粒稳定性 [10]，但本研究中碳源添加葡萄糖时，并不利于重组菌生长和产天冬氨酸转氨酶活性也较低，可能是葡萄糖代谢产生大量乙酸不利于菌体生长 [11]，而淀粉需经水解为单糖后才能被菌体利用，缓和了菌体的代谢产生大量的乙酸从而利于重组菌的生长与质粒稳定性。柠檬酸氨的添加对质粒稳定性基本没有影响，对菌体前期生长则有明显促进作用，但前期实验中在LB培养基中柠檬酸铵的添加会导致菌体生长过早进入衰亡期，在添加过量玉米浆的CSN培养基中并未见到该现象，应该是菌体生长过程中优先利用了玉米浆中的营养物质，缓和了柠檬酸氨的作用。
Figure 5. Effect of corn steep liquor on the stability of plasmid and biomass of recombinant E. coli
图5. 玉米浆对重组菌质粒稳定性和生物量的影响
Figure 6. Effect of starch on the stability of plasmid and biomass of recombinant E. coli
图6. 淀粉对重组菌质粒稳定性和生物量的影响
Figure 7. Effect of NaCl on the stability of plasmid and biomass of recombinant E. coli
图7. 柠檬酸氨对重组菌质粒稳定性和生物量的影响
3.4. 培养基对外源基因表达的影响
分别取培养12小时的重组菌的发酵液，离心收集菌泥，以生理盐水稀释，640 nm处测定其生长OD，稀释OD值至1，取100 μl破壁后做SDS-PAGE电泳，结果见图8。该菌株构建的表达体系启动子较弱，外源基因表达量偏低，但可以明显看到重组菌在LB培养基和CSN培养基中均有高于宿主菌加强的一条天冬氨酸转氨酶的电泳条代(蛋白分子量43 kd)。图8结果表明，在相同菌体生物量的情况下，同一菌株在LB培养基的外源基因表达量要略高于CSN培养基。相同生物量OD600条件下，CSN培养基发酵获得的菌体比酶活较LB培养基提高110%，说明CSN培养基在外源基因表达数量上低于LB培养基，但酶活性反而更高，可能是CSN培养基菌体生长快，菌体内生物资源利用偏向于菌体生长，导致外源基因表达量偏低。但表达量低反而有利于新合成蛋白的折叠，形成的包涵体较少，LB培养基表达蛋白包涵体较多导致 [6] [12]。
泳道1. LB培养基；泳道2. CNS培养基；泳道3. 空宿主BL21对照；泳道4. Mark。
Figure 8. Effect of NaCl on the stability of plasmid and biomass of recombinant E. coli
图8. 柠檬酸氨对重组菌质粒稳定性和生物量的影响
4. 结论
1) 优化后培养基所需成份均为廉价易得的工业产品，最佳配方为：玉米浆45 ml/L，淀粉2 g/L，柠檬酸氨1 g/L。优化后发酵体系培养基成本仅为优化前10%左右，菌体生物量提高50%，外源基因表达转氨酶比酶活提高110%，质粒的稳定性也得到明显改善。该培养基适用于工业大规模发酵。
2) 优化后培养基中从组份分析，淀粉作为碳源仅为2 g/L，而且淀粉对菌体生长及产酶影响较小，主要起到稳定外源基因的作用。菌体生长所需营养物质大多来自玉米浆和柠檬酸氨，且玉米浆对菌体生长，产酶及外源基因质粒稳定性均有较大影响。
3) 优化后的培养基不需要添加辅酶，成本进一步降低，以优化后的发酵液为酶液，转化苯丙酮酸制备L-苯丙氨酸，转化率比优化前的LB培养基发酵液为酶液提高了18%。
本研究采用的培养基CSN价格不仅远低于LB培养基，所含营养物质和生长因子也更为丰富，更适于菌体的生长，从成本上也更利于工业化生产的需要，而且相对于LB培养基，也更有利于基因工程菌质粒的稳定性。对基因工程菌的大规模发酵条件的探索具有较高的指导意义。
基金项目
国家一流本科专业和江苏省品牌专业建设工程；国家重点研发计划项目(2019YFA0905200)。
附录
pte22b+aspC质粒图谱
1 agcttgcgtt tgtcatcagt ctcagcccgc ttttcagcgg gcttcattgt ttttaatgct
61 tacagcactg ccacaatcgc ttcgcacagc ggagccatgt tatctggtgt catcccggcc
121 acatttacgc gaccagaagc aaccgcatat acgccaaact cttcgcgcag acgcagcact
181 tgttcttttg tcaggccact gaaggagaac atgccgttct gtttgatgat aaagctgaag
241 tcgcggtttg cgcctttttc ctgcagcgta ttgacgaaca actgacgcat acgctgaata
301 cgctggcgca tatcagtcag ctcttgttcc caaatcgcac gtaacgcatc gttgctcagg
361 atggtggcaa caacagaagc gccgtgtgct ggtgggttag agtagttagc gcgaatcgcc
421 gctttcattt ggctgaatgc gcgatcaacg gtttcactgt cggcagcaac cagagtacaa
481 gcgccaacac gctcgttgta caggccaaag tttttagagt aggaactggc aacaatcagc
541 tctttatgca tagccgcgaa agcgcgcagt ccttcagcat cttcttccag accacgggca
601 aaaccctggt aagcgaagtc aaacagcggt aaccagcctt tctcaacgga gagttgtgcc
661 agtgtttgcc attgttccag cgtagggtcg ataccggttg ggttatggca gcagccatgg
721 aacagcacta cgtcgccagc ctgagcttca ttcaggctgt taatcagtgc atcgaagtca
781 agagtgtgat tttccgcatc ataataagcg tattcacgaa cttccagacc tgcagagtta
841 aagacgctct tatggttcgg ccagcttggg ttgctcaccc acacacgctt aacgctggta
901 ttttttgcca ggaaatcggc agccacgcgt agtgcgccag tgccccccgg agtctgtgcc
961 gtgcgagcac gtttgtcatt gatcagggcg ctacctttac caaacagcag ttcctgagtg
1021 cagcgaccaa attcagggat gccgtcaatg ccgaggtaat ttttggtggt ttcattttcg
1081 agcagatact gttcagcctt tttcacgctg gtcagtaccg gggttttgcc cgtctcatct
1141 ttatagacac caatcccgag gttaattttg ccgggacgtt catcggcacg aaacagatcg
1201 gccaggccca gaatcgggtc ggcaggagcg gcggtaatgt tctcaaacat gacgaggttc
1261 cattatggtt acagaaggga agtccgctat cagggtaacg ggagatttac aaaattccaa
1321 ctattactga tgaaaacgca ggctgttttt gcaagacgtg agattgcttg gaaggtaccg
1381 agctcgaatt cggatccgaa ttaattccga tatccatggc catcgccggc tgggcagcga
1441 ggagcagcag accagcagca gcggtcggca gcaggtattt catatgtata tctccttctt
1501 aaagttaaac aaaattattt ctagagggga attgttatcc gctcacaatt cccctatagt
1561 gagtcgtatt aatttcgcgg gatcgagatc tcgatcctct acgccggacg catcgtggcc
1621 ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg
1681 gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca
1741 ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg
1801 gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag
1861 ggagagcgtc gagatcccgg acaccatcga atggcgcaaa acctttcgcg gtatggcatg
1921 atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg aaaccagtaa cgttatacga
1981 tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc cgcgtggtga accaggccag
2041 ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg atggcggagc tgaattacat
2101 tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg ttgctgattg gcgttgccac
2161 ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg gcgattaaat ctcgcgccga
2221 tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga agcggcgtcg aagcctgtaa
2281 agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg ctgatcatta actatccgct
2341 ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct
2401 tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc tcccatgaag acggtacgcg
2461 actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc
2521 attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa
2581 tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca
2641 aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca
2701 gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat
2761 ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac
2821 catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc
2881 tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac
2941 caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca
3001 gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtaa
3061 gttagctcac tcattaggca ccgggatctc gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag
3121 tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct
3181 ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc ggcgaggacc
3241 gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga atcttgcacg
3301 ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag aagcaggcca
3361 ttatcgccgg catggcggcc ccacgggtgc gcatgatcgt gctcctgtcg ttgaggaccc
3421 ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga atcaccgata cgcgagcgaa
3481 cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc aacaacatga atggtcttcg
3541 gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc gccctgcacc attatgttcc
3601 ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac acctacatct gtattaacga
3661 agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg ccgcatccat accgccagtt
3721 gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc atcagtaacc cgtatcgtga
3781 gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa cagaaatccc ccttacacgg
3841 aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc
3901 agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gcagacatct
3961 gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg
4021 atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag
4081 cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg
4141 gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc
4201 atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc
4261 gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc
4321 tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc
4381 acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg
4441 aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat
4501 cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag
4561 gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga
4621 tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg
4681 tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt
4741 cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac
4801 gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc
4861 ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt
4921 ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc
4981 ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc
5041 agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg
5101 aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag
5161 atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg
5221 tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt
5281 tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca
5341 tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca
5401 gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc
5461 tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt
5521 ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg
5581 gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc
5641 aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg
5701 ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga
5761 tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga
5821 ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta
5881 aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg
5941 ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact
6001 ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata
6061 agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt
6121 tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa
6181 ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg aaattgtaaa cgttaatatt
6241 ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa
6301 atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca
6361 gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc
6421 gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg
6481 aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg
6541 ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg
6601 gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg
6661 ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccaatc cggatatagt tcctcctttc agcaaaaaac
6721 ccctcaagac ccgtttagag gccccaaggg gttatgctag ttattgctca gcggtggcag
6781 cagccaactc agcttccttt cgggctttgt tagcagccgg atctcagtgg tggtggtggt
6841 ggtgctcgag tgcggccgca