臭氧暴露生物标志物研究探讨

Research on Biomarkers of Ozone Exposure

摘要: 臭氧(O₃)暴露可引起呼吸、心血管循环等组织或器官的损伤，且伴随O3暴露浓度升高、时间延长，细胞凋亡率升高，组织毒性不断增强。然而目前O₃致生物损伤的潜在分子机制还未能被充分认识。生物分子标志物以其高灵敏性、特异性和预警性等特点，已成为在分子毒理学、预防医学、环境医学中研究的重要工具。本文通过综述探讨O₃生物毒性评价的生物标志物的主要类型，及其在机体中的作用机制及其应用现状。O3暴露致机体损伤的分子标志物可分为三类：1) 炎症反应生物标志物，包括炎症细胞(如巨噬细胞、白细胞)和炎症因子(如IL-1β、IFN-γ、TNF-α)。2) 氧化应激生物标志物，包括脂质过氧化生物标志物(如MDA、4HNE、iNOS)、抗氧化防御系统生物标志物(如GSH、HSP、Nrf2)。3) 细胞信号通路因子(如Nrf2、NF-κB、TLR、MAPK)。生物标志物的连续监测可预防O₃致生物损伤的进一步发展，并为O₃致生物损伤机制提供新的研究思路。

Abstract: Ozone (O₃) exposure can cause damage to tissues or organs such as respiration and cardiovascular circulation, and with the increase of O₃ exposure concentration and time, the apoptosis rate increases, and the tissue toxicity continues to increase. However, the underlying molecular mechanism of O₃-induced biological damage has not been fully understood. Biomarkers have become an important tool in molecular toxicology, preventive medicine and environmental medicine because of their high sensitivity, specificity and early warning. This paper discusses the main types of biomarkers for O₃ biotoxicity evaluation, their mechanism of action in the body and their application status through a review. The molecular markers of body damage caused by O₃ exposure can be divided into three categories: 1) Inflammatory biomarkers, including inflammatory cells (e.g., macrophages, leukocytes) and inflammatory factors (e.g., IL-1β, IFN-γ, TNF-α). 2) Oxidative stress biomarkers, including lipid peroxidation biomarkers (such as MDA, 4HNE, iNOS), and antioxidant defense system biomarkers (such as GSH, HSP, Nrf2). 3) Cell signaling pathway factors (such as Nrf2, NF-κB, TLR, MAPK). Continuous monitoring of biomarkers can prevent the further development of O₃-induced biological damage and provide new research ideas for the mechanism of O₃-induced biological damage.

1. 前言

O₃是大气污染中主要的二次污染物成分，也是光化学污染的主要组分，环境中的氮氧化物(nitrogen oxide, NOx)和挥发性有机物(Volatile organic compounds, VOCs)在日光紫外线的作用下时，经过一系列光化学反应生成一种具有特殊臭味的呈淡蓝色的气体。自2013年我国实施《大气污染防治行动计划》以来，已经制定了一系列严格的污染物排放标准和污染的控制措施。以PM2.5为首要污染物的环境污染超标天数比例逐渐降低，空气重污染天数明显减少，蓝天天数明显增加 [1]。然而，空气质量优良天数的比例却没有增长，甚至出现下降 [2]。近年来我国空气环境的O₃污染问题凸显 [3]。急性O₃暴露早期可诱发生物机体发生强烈氧化应激，引起细胞炎症反应和组织损伤。O₃对机体的危害最终是通过其与机体内各种生物分子相互作用实现的。因此，对与之相关的生物标记物的研究是完善O₃污染对机体损伤情况评价的一种简便、有效的方法。生物标志物不仅能够反映机体的状态，并且可以提供机体损伤的早期预警信号，可作为监测的重要方向，连续监测可做到早防早治，防止损伤的进一步发展。为探求新的疗法、新的药物筛选奠定基础，并为O₃致生物损伤的机制研究提供参考。本文对环境O₃毒性评价的生物标志物：炎症因子、氧化应激反应因子及细胞通路因子进行综述。

2. 炎症标志物

O₃通过呼吸道进入肺循环后，使肺泡巨噬细胞积聚并激活，刺激组织产生一系列与炎症相关的因子，主要包括存在于肺泡灌洗液(BALF)和血液中的白细胞、中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞、白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、干扰素γ (INF-γ)、巨噬细胞炎症蛋白1α (MIP-1α)等，最后导致肺和机体的炎症损伤 [4]。已有大量的实验将炎症细胞和炎症因子作为生物标志物对O₃的生物损伤机制和危害效应进行研究。

2.1. 炎症细胞

O₃能对气道上皮产生明显的氧化损伤作用，促使上皮细胞合成和分泌大量的炎症细胞及炎症因子。陈庆梓 [5] O₃暴露小鼠检查肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、巨噬细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数较对照组小鼠均显著增多。O₃暴露导致支气管哮喘大鼠肺功能下降，同时BALF中炎性细胞增多 [5]。有研究者认为，BALF中的白细胞总数是反映炎症损伤程度的标志 [6]，Wagner [7] 等人也证实了O₃引起肺的损伤更多的是中性粒细胞炎症。

由于血液标本的获取更加便利以及血常规检测的普及，炎症细胞作为O₃氧化应激标志物已经有了一定的实用意义，所以炎症细胞检测在医疗中的作用广泛。但炎性细胞的表达对组织、器官的敏感性、特异性较低，而且炎症细胞在低浓度O₃暴露和O₃暴露早期不能够反映机体的损伤情况。

2.2. 炎症因子

在O₃暴露后，多种炎症因子的含量发生明显的变化，如IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、INF等，提示这些炎症因子参与O₃暴露损伤发生过程。这些炎症因子在O₃急性期明显增多，加重炎症反应，通过激活细胞凋亡和抑制细胞再生，进而导致机体各种代谢异常和功能损害。梁婷婷 [8] 将大鼠暴露O₃后，血浆中的炎症因子IL-6、CRP、可溶性细胞间粘附因子-1 (sICAM-1)、TNF-α升高。Backus [9] 等将小鼠暴露于O₃气体，可引起小鼠的BALF内的TNFα、IL-1β、IL-6和MIP-1α等炎症因子含量升高。Hu [10] 低剂量O₃暴露对53名志愿者进行暴露研究，在不同场景和暴露时间发现，血液中炎症因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17A、IFN-γ和TNF-α含量发生显著改变，且具有统计学意义。

3. 氧化应激生物标志物

3.1. 脂质过氧化生物标志物

O₃通过呼吸道吸入和皮肤接触进入等方式进入生物体内，诱发机体发生氧化应激(ROS或RNS的过量表达)，ROS与生物膜的磷脂、膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质，发生脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物如丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯酸(4-HNE)等，从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能的改变。MDA被认为是反映机体脂质过氧化的生物标志物，可间接反映细胞受自由基损伤的程度，因此可通过测定其了解膜脂质过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度。MDA作为脂质过氧化的稳定产物，O₃通过降低GSH和增加MDA来加剧氧化损伤，已被普遍用作全身的生物标志物。Li [11] 等人将8~10周C57BL/6鼠2.5 ppm浓度O₃暴露3 h，实验结果为，O₃暴露组小鼠肺组织匀浆MDA水平明显升高，谷胱甘肽/谷胱甘肽水平降低。肺组织MDA含量的上升、GSH含量的下降，表明小鼠肺部氧化还原平衡被打破，造成了明显的氧化损伤。Perepu [12] 将缺血再灌注模型的大鼠暴露于0.8 ppm O₃中，暴露O₃的缺血再灌注心肌中MDA水平明显增加，引起心肌细胞的凋亡。4-HNE被认为是氧化应激的标志物，在介导各种信号通路中发挥重要作用 [13]。4-HNE水平过高的后果是包括蛋白质和DNA加合物的形成，导致DNA损伤、线粒体功能障碍和细胞凋亡。而4-HNE蛋白加合物被认为是脂质过氧化和蛋白质氧化损伤的标志。Pecorelli [14] 将人表皮细胞暴露在0.4 ppm O₃中，暴露上皮细胞中4-HNE加合物显著高于对照组。Connor [15] 将C3H/HeOuJ小鼠急性暴露于O₃ (0.8 ppm, 3 h)后，FBAL中的4-羟基壬醛修饰蛋白水平升高。

3.2. 抗氧化损伤生物标志物

自由基将刺激机体产生一系列抗氧化的酶类物质，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)等，从而抵御O₃引起的氧化损伤，维护组织和器官正常功能。王科霖 [16] 将人呼吸道上皮细胞暴露于O₃实验中，发现与对照组(无菌空气)相比O₃暴露组的呼吸道上皮细胞内GSH/GSSG值降低，而SOD活力升高，表明O₃能对呼吸道上皮细胞造成氧化损伤，改变细胞内的氧化还原状态。热休克蛋白(HSP)通常被认为是细胞内的蛋白质，具有抵御感染和细胞应激的保护功能，作为分子伴侣促进蛋白质折叠。这些分子伴侣可调节细胞内稳态，促进细胞存活，并影响细胞凋亡。本实验组已得出低浓度O₃对酵母细胞线粒体损伤早于细胞核，HSP60、HSP70的表达量与O₃暴露浓度呈现出时间累积效应。

4. 细胞信号通路因子

细胞信号通路因子包括膜受体、细胞内激酶和磷酸酶，以及调节炎症基因的转录因子等。机体有着复杂而且严密的信号通路机制，在细胞周期、生长、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用，维持机体的稳定。在O₃暴露损伤中能够作为生物标志的信号通路因子有Toll受体(TLR)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子-κB (NF-κB)信号通路、核因子E2相关因子2 (Nrf2)等。Rivas [17] 在O₃暴露大鼠实验中，NF-κB因子在30天时血清检测达到最高。Connor等[15]使用TLR4突变的C3H/HeJ小鼠进行O₃暴露研究，实验结果表明功能性TLR4有助于O₃诱导的无菌炎症和巨噬细胞的激活，并在C3H/HeOuJ对照组小鼠的肺泡巨噬细胞中，观察到吸入O₃后NF-κB活性随时间的增加。O₃暴露可以激活正常小鼠气道平滑肌中的p38MAPK活性，Church [18] 等将雄性，10~14周龄MKP-1^-/-小鼠，暴露在3 ppm浓度O₃，实验发现，抑制p38MAPK信号通路的活化可以减少IL-6的分泌，减轻甚至逆转肺血管重塑。在p38MAPK激活之后是MAPK激活蛋白激酶-2 (MK2)的下游激活，这反过来导致热休克蛋白(HSP)27的磷酸化。p38MAPK被炎症细胞因子和细胞应激(包括氧化应激)激活，参与细胞增殖、凋亡和炎症等细胞过程，并引起气道平滑肌(ASM)收缩反应。已有报道，p38MAPK通路参与O₃诱导的正常小鼠AHR和肺部炎症，对哮喘恶化的影响起着重要作用 [19]。

5. 展望

O₃毒性作用机制中，主要通过诱导细胞产生氧化应激和炎症反应、信号通路改变等途径来致病，涉及多种分子机制。虽然，已经证明暴露于高浓度O₃中可以引起氧化应激和炎症反应，但是具体的致病机制及病因并不完全明确。特别是细胞信号通路作为细胞对外界刺激的感受器、信号接收器，并激活细胞内一系列的生物化学反应，长时间过度刺激后导致炎症和氧化应激，最终导致细胞凋亡或遗传毒性 [20]。目前研究通常停留在O₃暴露导致的有害因子的异常，某单一细胞信号通路途径所致，很少涉及多个信号通路的协调关系。今后的研究把明确各炎症因子与相关多个信号通路的调控机制相结合，为进一步深入探究O₃与疾病的发生途径以及分子机制。有助于预防和控制O₃污染的防范及相关疾病的发生和恶化。

基金项目

国家重点研发计划项目(2017YC021280402)。