摘要: 背景：系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)是一种复杂的多器官多系统受累的自身免疫性疾病，其病因尚未阐明。已有研究表明环状RNA (circRNA)在人体组织和器官中广泛表达，作为内源竞争RNA (ceRNA)与微小RNA (miRNA)结合，在SLE中发挥重要作用。课题组前期通过高通量测序分析筛查SLE患者血清circRNA提示circ-0007385表达异常，可能参与SLE发病。目的：本研究旨在探究SLE患者外周血单个核细胞(PBMC)中circ-0007385的表达水平并分析其意义，为SLE的早期诊断寻找新型生物标志物。方法：选取初发SLE患者60例(活动期34例、稳定期26例)作为SLE组，健康人30例作为对照组。通过高通量测序分析受试者外周血PBMC中的circRNA表达水平，采用RT-qPCR法检测所有受试者血清circ-0007385、miR-181b的表达水平，生物信息技术构建circRNA-miRNA相互作用的网络，采用受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic, ROC)曲线分析血清circ-0007385、miR18-1b对于初发SLE诊断的特异性、敏感度和曲线下面积(Area Under the Curve, AUC)。结果：1) SLE患者外周血PBMC中circ-0007385较对照组显著升高(p < 0.01)，且与疾病活动度指标dsDNA抗体正相关(r = 0.6839 p < 0.001)和SLE疾病活动指数(SLEDAI-2K)评分正相关(r = 0.5933 p < 0.01)，与补体C3负相关(r = −0.6617 p < 0.05)。2) 生物信息技术预测circ-0007385与miR-181b特异结合位点，RT-qPCR结果显示，SLE患者外周血PBMC中miR-181b的表达量与对照组相比显著降低(p < 0.01)，并与circ-0007385表达量成负相关(r = −0.5839 p < 0.01)。3) ROC曲线分析表明，外周血PBMC中circ-0007385和miR-181b表达水平可以区分初发SLE患者与对照组，二元逻辑回归模型表明，circ-0007385联合miR-181b可以提供更佳的诊断准确性，曲线下面积(AUC)为0.9078 (敏感性为0.85，特异性0.87)。结论：本研究表明，外周血PBMC中circ-0007385联合miR-181b在预测SLE发病中具有一定的诊断价值，并且与初发SLE患者疾病活动度显著相关。
Abstract:
Background: Systemic lupus erythematosus (SLE) is a complex autoimmune disease involving multiple organs and multiple systems, and its etiology has not been clarified. Previous studies have shown that circle RNA (circRNA) is widely expressed in human tissues and organs, and plays an important role in SLE as a competitive endogenous RNA (ceRNA) binding to microRNAs (miRNA). In the early stage, the research group screened the serum circRNA of SLE patients through high-throughput sequencing analysis, suggesting that circ-0007385 expression was abnormal, which may be involved in the pathogenesis of SLE. Objective: This study aims to explore the circ-0007385 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with SLE. The expression level of circ-0007385 and its significance were analyzed to find new biomarkers for early diagnosis of SLE. Methods: 60 patients with primary SLE (34 patients in active phase, 26 patients in stable phase) were selected as SLE group, and 30 healthy people as control group. The circRNA expression level in peripheral blood PBMC of the subjects was analyzed by high-throughput sequencing. The expression level of circ-0007385 and miR-181b in serum of all subjects was detected by RTqPCR. The circRNA-miRNA interaction network was constructed by bioinformatics technology. The specificity of circ-0007385 and miR-181b in serum for the diagnosis of primary SLE was analyzed by receiver operating characteristic (ROC) curve results of sensitivity and area under the curve (AUC). Results: 1) Circ-0007385 in peripheral blood PBMC of SLE patients was significantly higher than that of the control group (p < 0.01), and was positively correlated with dsDNA antibody (r = 0.6839 p < 0.001) and SLEDAI-2K score (r = 0.5933 p < 0.01), negative correlation with complement C3 (r = −0.6617 p < 0.05). 2) Bioinformatics predicted the specific binding sites of circ-0007385 and miR-181b. RT-qPCR results showed that the expression of miR-181b in peripheral blood PBMC of SLE patients was significantly lower than that of control group (p < 0.01), and compared with that of circ-0007385 expression was negatively correlated (r = −0.5839 p < 0.01). 3) ROC curve analysis showed that circ in peripheral blood PBMC circ-0007385 and miR-181b expression levels can distinguish patients with primary SLE from the control group. The binary logistic regression model shows that circ-0007385 combined with miR-181b can provide better diagnostic accuracy, and the area under the curve (AUC) is 0.9078 (sensitivity is 0.85, specificity is 0.87). Conclusion: This study shows that circ-0007385 combined with miR-181b in peripheral blood PBMC has certain diagnostic value in predicting the incidence of SLE, and is significantly related to the disease activity of patients with primary SLE.
1. 背景
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及多器官的自身免疫性疾病，其特征在于产生多种自身抗体引起慢性炎症 [1]。SLE的发病机制是多因素的，遗传、环境、激素和表观遗传因素参与其发生、发展，疾病具有多样化的临床表现 [2]，临床工作中如何早期诊断SLE面临挑战，因此，寻求早期诊断SLE的新型生物标志物至关重要 [3] [4]。最近的研究进展已经开始揭示环状RNA在SLE中的作用，为SLE的发病机制提供了新的认识 [5]。环状RNA(circRNA)是一种特殊的非编码RNA，由RNA聚合酶II转录形成共价闭合的单链环状RNA分子，没有5'帽和3'多(A)尾 [6]。研究表明，环状RNA在人体组织和器官中广泛表达，作为竞争性内源性RNA(ceRNA)与微RNA(miRNA)结合，在转录和转录后水平上调节基因表达，与SLE的发病密切相关 [7] [8]，本研究旨在探究SLE患者外周血单个核细胞(PBMC)中circ-0007385的表达水平并分析其与疾病活动度的关系，为SLE的早期诊断寻找新的靶点。
2. 实验方法
2.1. 样本收集
本研究选取在青岛市市立医院风湿免疫科收治的60例初发SLE患者，所有SLE患者均符合美国风湿病学会(ACR)1997年诊断标准，排除合并其他自身免疫系统疾病者，合并肝、肾、心脏功能障碍等严重疾病者，合并肿瘤、感染性疾病者，不配合医生治疗者，一个月内未服用过糖皮质激素或者免疫抑制剂者。其中男6例，女54例；年龄 20~69岁，中位年龄39岁，作为SLE组。采用系统性红斑狼疮活动指数2000 (Systemic lupus erythematosus disease activity index 2000, SLEDAI-2k)进行评估，评分与等级的判定如下：疾病无活动(分数 = 0~4分)、轻度疾病活动(分数 = 5~9分)、中度疾病活动(分数 = 10~14分)、高度疾病活动(分数 ≥ 15分)并由青岛市市立医院风湿免疫科专科医生评估认定，将60例SLE患者分为两组：分为活动期组(分数 > 9分，34例)、稳定期组(分数 < 5分，26例)。选择同期在本院健康体检的志愿者30例作为对照组，其中男3例、女27例，年龄19~68岁、中位年龄38岁。各组受试者性别、年龄无统计学差异。该研究获得青岛市市立医院医学伦理委员会批准，所有参与研究的受试者均签署了同意书。
2.2. 血液样品制备
通过静脉穿刺采集健康人及SLE患者血液样本(5 mL)，在收集样本后4小时内，使用人外周血淋巴细胞分离培养基(天津灏洋生物制品厂，中国天津)分离外周血单个核细胞(PBMC)用于定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。
2.3. 高通量测序
使用Illumina HiSeqTM 2500测序平台(美国加利福尼亚州圣地亚哥市伊卢米纳)对十组样品(5组初发SLE患者对5组健康对照)进行测序，对原始序列数据进行生物信息学分析
2.4. 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
使用TRIzol试剂(VAZYME，美国)提取和纯化总RNA，并使用等量的总RNA (1 μg)在42℃下反应60分钟，在95℃下反应3分钟(Bio Rad，美国)以获得cDNA模板，使用SYBR Green PCR混合物(BeiJing TIANGEN，中国北京)对cDNA (1 μL)进行qRT-PCR扩增分析(美国应用生物系统公司)，circ-0007385引物序列T:5'‐CGTGACCCAGAAGTGCGTTCACA-3'F:5'-TGGGGGTGTATCAGTCTTTGGTT-3'，GAPDH作为内部对照，引物序列为Forward：5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3，Reverse： 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3')作为。反应条件如下：95℃下反应15分钟，在94℃下反应20秒，在60℃下反应34秒，共40个循环。分析了熔解曲线，每个样品设置三个重复孔，相对表达水平用2−ΔΔt。
2.5. 统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, USA)进行。定量资料以
表示，多组间比较采用单因素方差分析，有差异后进行Turkey检验比较每组之间的差异，方差齐且呈正态分布的数据两组间比较采用Student’s t检验进行比较，非正态分布的数据两组间比较采用之秩和检验进行比较，相关性分析采用Pearson相关分析法。采用接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC曲线)分析circRNA与miRNA用于诊断SLE的灵敏度与特异度。p < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. SLE患者外周血PBMC中circ-0007385的表达差异及临床意义
1) 前期课题组采用高通量测序技术检测分析健康对照(n = 5)、初发SLE患者(n = 5)外周血PBMC中的circRNA表达谱，两组circRNA的整体分布显示有194个circRNA (100个显著上调和94个显著下调)显著表达差异。本研究选取表达差异超过2倍的3个circRNA (circ-0002416、circ-0000387、circ-0007385)，使用RT-qPCR进行验证，初发SLE患者与对照组相比，仅有circ-0007385表达量(1.76 ± 0.22)的上调具有统计学意义(p < 0.05)，circ-0002416表达量(1.12 ± 0.18)、circ-0000387表达量(1.08 ± 0.16)与对照组差异无统计学意义(p > 0.05)，RT-qPCR结果显示活动期组、稳定期组、对照组外周血PBMC中circ-0007385表达量分别为1.88 ± 0.29、1.58 ± 0.21、1.07 ± 0.38，活动期组表达量显著高于稳定期组，稳定期组表达量显著高于对照组，两两相比，p均 < 0.01。
2) SLE患者外周血PBMC中circ-0007385表达与SLE疾病活动度显著相关
将SLE患者外周血PBMC中circ-0007385的表达量与疾病活动期指标(抗dsDNA抗体、SLE疾病活动指数2000、补体C3、24 h尿蛋白定量、免疫球蛋白、抗sm抗体)进行相关性分析，结果显示，circ-0007385表达量与抗dsDNA抗体显著正相关(r = 0.6839 p < 0.001)，与SLE疾病活动指数2000 (SLEDAI-2 K)评分显著正相关(r = 0.5933 p < 0.01)，与补体C3显著负相关(r = −0.6617 p < 0.01)，与24 h尿蛋白定量、免疫球蛋白、抗sm抗体之间没有相关性。
3.2. circ-0007385可能作为内源竞争RNA与miR-181b特异性结合发挥作用
1) circRNA-miRNA相互作用的网络构建
使用argetscan，miRanda，PITA，RNAhybrid，and RNA22五种方法预测circ-0007385与miRNA保守序列的潜在结合，在超过3000种相互作用中鉴定出100个潜在结合的miRNA。通过PubMed和Embase数据库找到与SLE相关的miRNA，将数据合并后，确定了67个miRNA。基于已有的研究，利用SLE的蛋白质结合、RNA剪接和核酸结合等基本特征对新构建的circRNA-miRNA-SLE数据库中的miRNA进行排名，我们发现miR-181b在其他67个miRNA中得分最高。
2) SLE患者外周血PBMC中miR-181b表达量显著下调
RT-qPCR结果显示在SLE组与对照组外周血PBMC中miR-181b表达量分别为0.79 ± 0.22、1.0 ± 0.23，两者相比，SLE组显著降低(p < 0.05)，且SLE组miR-181b表达量与circ-0007385表达量成显著负相关(r = −0.5839 p < 0.01)。
3.3. circ-0007385联合miR-181b评估SLE患者诊断的ROC曲线分析
通过ROC曲线分析研究了外周血PBMC中circ-0007385、miR-181b作为SLE患者潜在诊断指标的价值，circ-0007385用于区分SLE患者与健康人组的AUC为0.7878 (敏感性为0.76，特异性0.84，p < 0.01)，miR-181b用于区分SLE患者与健康人组的AUC为0.7428 (敏感性0.81，特异性为0.77，p < 0.01)，用二元逻辑回归算得在用circ-0007385联合miR-181b诊断SLE时其前的系数(circ-0007385 & miR-181b = 1.112circ-0007385 + 1.004miR-181b，ROC分析结果显示circ-0007385联合miR-181b可以提供最佳的诊断准确率，AUC为0.9078 (敏感性为0.85，特异性0.87，p < 0.01)，如图1。
Figure 1. circ-0007385 combined with miR-181b ROC curve analysis
图1. circ-0007385联合miR-181b的ROC曲线分析
上述结果表明，初发SLE患者外周血PBMC中circ-0007385联合miR-181b在预测SLE患者发生有一定的诊断价值。
4. 讨论
系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其特征在于多个自身抗体的产生 [9]，免疫复合物沉积和多个器官损伤，早期诊断、及时治疗可预防严重并发症发生，延长患者生存期 [10]。研究表明，失调的circRNA与SLE的发生和发展密切相关 [11] [12]，有研究显示，人全血中circ-0004156和circ-0082626明显升高，与疾病活动性、自身抗体产生以及临床症状密切相关，可作为SLE的潜在诊断及鉴别诊断标志物，同时可作为评估疾病严重程度和活动性的指标 [13]。2011年，Salmena等人首次提出了竞争性内源性RNA (ceRNA)假说 [14]，该假说指出，一些RNA作为ceRNA，可以通过竞争目标miRNA上mRNA的共同结合位点来改变目标miRNA的功能。越来越多的研究表明，circRNA可以作为ceRNA，通过竞争共享的miRNA来调节靶标mRNA的表达 [15] [16]。本研究中，circ-0007385被证实在SLE患者的外周血PBMC中显著上调，与疾病活动度指标如：抗dsDNA抗体、SLEDAI2K评分和补体C3显著正相关，通过ROC曲线分析，在SLE的诊断中，ROC分析结果显示circ-0007385联合miR-181b的敏感性为0.85，特异性为0.87，AUC为0.9078 (p < 0.05)，这表明circ-0007385可作为辅助SLE诊断、评估SLE疾病活动性的相关指标。
近年来，生物信息学分析被广泛用于帮助筛选关键基因，构建调控模型 [17]，选择可能参与免疫疾病发展和预后的治疗靶点，为基础和临床研究提供指导 [18]，有助于明确免疫疾病的发病机制，指导临床治疗 [19]。为了进一步研究circ-0007385潜在作用机制，通过生物信息学分析构建了鉴定出一个差异表达的circRNA-miRNA网络，针对SLE的蛋白质结合、RNA剪接和核酸结合等基本特征对新构建的circRNA-miRNA - SLE数据库中的miRNA进行筛选，选取特征最相关的miR-181b并通过RT-qPCR验证，本研究结果表明，SLE外周血PBMC中circ-0007385预测SLE发病具有一定的诊断价值，与初发SLE患者疾病活动度有明显相关性。在SLE组中，外周血PBMC中miR-181b的相对表达量与对照组相比显著降低，并与circ-0007385表达量成负相关，推测circ-0007385在SLE中的作用可能通过结合miR-181b来实现。
5. 研究局限及展望
越来越多的证据表明，circRNA是免疫细胞发育和免疫调节多个阶段的积极参与者 [20]，不仅可以作为人类自身免疫性疾病的诊断生物标志物，还可以代表疾病的活动度或严重程度 [21]。circRNA通过充当miRNA海绵来调节许多生物过程，包括DNA甲基化、免疫反应和炎症反应，从而促进自身免疫性疾病的发展 [22]。因此，探究circRNA在系统性红斑狼疮中的表达变化具有重要意义。
本研究中，我们已经详细介绍了circ-0007385与SLE之间的密切关系，但对触发发病的分子机制了解甚少，除生物信息学分析外，尚缺乏关于SLE中circ-0007385分子机制的证据，该环状RNA在SLE中的分子机制和功能特性需要进一步证实，这可能会影响circ-0007385可以作为系统性红斑狼疮诊断生物标志物的结论的有效性和普遍性。作为内源性miRNA海绵的circRNA已经被广泛研究，但很少有circRNA/miRNA相互作用在自身免疫性疾病中得到实验验证，因此，深入研究circRNA的生物发生、细胞质中的积累、转录后的修饰可能会增加对其生物学功能的理解，有助于未来探索circ-0007385在SLE的发生发展中可能作用的分子机制。
NOTES
*通讯作者。