一测多评法同时测定三七血伤宁散中5种皂苷类成分的含量

Simultaneous Determination of Five Saponins in Sanqi Xueshangning Powder by Quantitative analysis of Multi-Components with Single Marker Method

摘要: 目的：建立一测多评法(Quantitative analysis of multi-components by single-marker, QAMS)同时测定三七血伤宁散中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I，5种成分的含量。方法：采用Agilent5Tc-C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相乙腈–水，梯度洗脱；体积流量1.1 mL/min；柱温25℃；检测波长210 nm，以人参皂苷Rb₁为内参物，建立其他四种成分的相对校正因子；通过一测多评法和外标法结果比较，验证一测多评法的准确性与实用性。结果：在一定线性范围内以人参皂苷Rb1为内参物，建立人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I的相对校正因子分别为0.7210、0.9011、0.9023、0.7598。一测多评法与外标法含量测定结果无显著性差异。结论：一测多评法可用于三七血伤宁散中五种不同成分的含量同时测定。

Abstract: Objective: To establish a quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS) method for the simultaneous determination of five components (Ginsenoside Rg₁, Ginsenoside Rb1, Ginsenoside Rd, Polyphyllin VII, Polyphyllin I) in Sanqi Xueshangning powder. Methods: The analysis was performed on an Agilent5Tc-C18 column ( 250 mm × 4.6 mm, 5 μm) at 25˚C, with mobile phase composed of acetonitrile-water at a flow rate of 1.1 mL/min in gradient elution mode, and the detection wavelength was set at 210 nm. Using Ginsenoside Rb₁ as internal substance, the relative correlation factors (RCFs) of four Saponins were calculated. By comparing the results of the external standard method (ESM) and QAMS methods, the feasibility and accuracy of QAMS method were verified. Results: The relative correlation factors of ginsenoside Rg₁, ginsenoside Rd, Polyphyllin VII and Polyphyllin I to ginsenoside Rb₁ were 0.7210, 0.9011, 0.9023, 0.7598, respectively. There was no significant difference between the QAMS and ESM in 20 batches of samples. Conclusion: The QAMS method is accurate and easy to operate, and can be used for the content simultaneous determination of Sanqi Xueshangning Powder.

1. 引言

三七血伤宁散收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂(第十七册)》(标准编号为WS3-B-3133-98)属于桂林三金独家产品，由三七、重楼、制草乌、大叶紫珠等中药组成，具有止血镇痛，祛瘀生新之功效。用于瘀血阻滞、血不归经之各种血证及瘀血肿痛，如胃、十二指肠溃疡出血，支气管扩张出血，肺结核咳血，功能性子宫出血，外伤及痔疮出血，妇女月经不调，经痛，闭经及月经出血量过多，产后瘀血，胃痛，肋间疼痛等 [1]，主要与其含有的皂苷类活性成分有关，因此，对皂苷类成分进行质量控制，是衡量三七血伤宁散的质量关键，因对照品用量大，价格昂贵等，另外本品中涉及的药味多，现有质量标准还不完善，难以从整体上把握产品质量 [2] [3]。因此本实验拟建立一测多评法同时测定人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I 5种成分(化学结构式见图1)的含量，此方法结果准确，重复性、稳定性良好，可作为三七血伤宁散成分分析、质量控制的依据。

2. 材料

2.1. 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Waters 2695-2996型高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；XP404型和XP205型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司KQ-8000E)；MILLI-Q超纯水仪(美国默克密理博公司)；色谱柱Agilent5Tc-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)、WelchUltimateXB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)及Agilent5Tc-C18 (2) (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)。

(1) (2) (3) (4) (5)

Figure 1. Chemical structure formula of five saponins. (1) Ginsenoside Rg₁; (2) Ginsenoside Rb₁; (3) Ginsenoside Rd; (4) Polyphyllin I; (5) Polyphyllin VIII

图1. 五种皂苷类成分的化学结构式。(1) 人参皂苷Rg₁；(2) 人参皂苷Rb₁；(3) 人参皂苷Rd；(4) 重楼皂苷I；(5) 重楼皂苷VII

2.2. 试药

人参皂苷Rd对照品(批号：111818-202104，纯度97.3%)、人参皂苷Rg₁对照品(批号：110703-202034，纯度94%)、人参皂苷Rb₁对照品(批号：110704-2016，纯度95%)、重楼皂苷VII (批号：111593-202105，纯度98.4%)、重楼皂苷Ⅰ (批号111590-202105，纯度94.5%)均购自中国食品药品检定研究院。三七血伤宁散(桂林三金中药研究所，批号S1-S15)；乙腈(色谱级，默克)，水为超纯水。

3. 方法与结果

3.1. 色谱条件

色谱柱：Agilent5Tc-C18柱 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈(A)；水溶液(B)，梯度洗脱(0~30 min, 19%~25% A; 30~60 min, 25%~35% A; 60~80 min, 35%~45% A; 80~100 min, 45%~52% A; 100~110 min, 45%~52%；见表1)流速：1.1 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：25℃；进样量：10 μl。在上述色谱条件下，各组分分离完全，分离度均 >1.5，阴性样品无干扰，理论板数均大于400,000。色谱图见图2。

(A)(B)

Figure 2. Chromatogram of mixed reference substance (A)and sample (B). (1. Ginsenoside Rg₁; 2. Ginsenoside Rb₁; 3. Ginsenoside Rd; 4. Polyphyllin VII; 5. PolyphyllinI)

图2. 混合对照品。(A) 及待测样品；(B) 色谱图。(1. 人参皂苷Rg₁；2. 人参皂苷Rb₁；3. 人参皂苷Rd；4. 重楼皂苷VII；5. 重楼皂苷I)

3.2. 溶液的配置

3.2.1. 混合对照品的配置

精密称量人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I对照品适量，置于10mL量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度线，摇匀，即得混合对照品溶液，混合对照品中，各成分浓度分别为人参皂苷Rg₁ 0.3899 mg/mL、人参皂苷Rb₁ 0.3333 mg/mL、人参皂苷Rd 0.1733 mg/mL、重楼皂苷VII 0.1823 mg/mL、重楼皂苷I 0.1688 mg/mL。

3.2.2. 供试品溶液的制备

取1.0 g三七血伤宁散样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷至室温，用甲醇补重，摇匀、过滤，并用0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

3.2.3. 阴性样品的制备

按三七血伤宁散的处方，制备缺三七和重楼的阴性样品，并按“3.2.2”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

3.3. 方法学考察

3.3.1. 线型关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液2、4、5、8、10 µL，按“3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以各组分峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，计算回归方程以及相关系数(R²)。结果(表1)表明，5个成分在相应的质量浓度范围内线性关系良好。

Table 1. Linear equation, correlation coefficient and linearity of 5 components

表1. 5种成分的回归方程、相关系数及线性范围

3.3.2. 精密度试验

取“3.1.1”项下对照品溶液，在“3.1”项色谱条件下进样测定6次，测得人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I峰面积RSD分别为0.68%、0.86%、0.79%、0.80%、1.02%，表明仪器精密度良好。

3.3.3. 稳定性试验

取同一供试品溶液，于0、3、6、9、12、18 h在“3.1”项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I峰面积RSD分别为0.50%、0.42%、1.80%、2.08%、1.57%。表明供试品溶液在18 h内稳定。

3.3.4. 重复性试验

取三七血伤宁散(批号S1)，按“3.2.2”项下，平行制备供试品溶液6份，进样，记录5个指标成分的峰面积。计算人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I含量的RSD分别为0.67%、0.73%、1.38%、0.94%、1.09%，表明该方法的重复性良好。

3.3.5. 加样回收实验

已测定的样品6份，取0.5g精密称定，分别精密加入各对照品溶液适量，按照“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率，结果人参皂苷Rg₁、Rb₁、Rd，重楼皂苷VII、I，的平均加样回收率分别为97.10%、98.92%、101.06%、96.24%、98.55%，RSD值分别为0.52%、0.79%、1.28%、0.51%、1.94%，表明方法的准确度高。

3.4. 相对校正因子的建立

采用多点校正法 [4] [5]，取均值作为QAMS定量用。

$f_{s/i}=f_s/f_i=A_s{C}_i/A_i{C}_s$ (1)

A_s为内参物对照品s的峰面积，C_s为内参物对照品s的质量浓度，A_i为待测成分对照品i的峰面积，C_i为待测成分对照品i的质量浓度。取“3.2.1”项下混合对照品溶液，在“3.1”项色谱条件下进样测定以人参皂苷Rb₁为内标，计算人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I的相对校正因子分别为0.7210、0.9011、0.9023、0.7598，并且各成分相对校正因子的RSD% < 0.7%。

3.5. 耐用性考察

3.5.1. 不同温度相对校正因子的影响

在相同条件下，采用Agilent5Tc-C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 µm)色谱柱和Agilent1260型高效液相色谱仪，考察不同温度(25、26、28、30℃)对人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I的相对校正因子的影响，结果显示各相对校正因子的RSD% < 0.70%，表明柱温对各成分的相对校正因子无显著影响。

3.5.2. 流速对相对校正因子的影响

在相同条件下，采用Agilent5Tc-C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 µm)色谱柱和Agilent 1260型高效液相色谱仪，考察不同温度(1.0、1.1、1.2 ml/min)对人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I的相对校正因子的影响，结果显示各成分相对校正因子的RSD% < 0.35%，表明流速对各成分相对校正因子无显著影响。

3.5.3. 波长对相对校正因子的影响

在相同条件下，采用Agilent5Tc-C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 µm)色谱柱和Agilent 1260型高效液相色谱仪，考察不同温度(203、206、210 nm)对人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷VII、重楼皂苷I的相对校正因子的影响，结果显示各成分相对校正因子的RSD% < 1.80%，表明波长对各成分相对校正因子无显著性影响。

3.5.4. 不同仪器和色谱柱

分别考察Waters 2695-2996型和Agilent 1260型高效液相色谱系统以及Agilent5Tc-C18、WelchUltimateXB-C18及Agilent5Tc-C18 (2) (规格均为4.6 mm × 250 mm, 5 µm)三种色谱柱对人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅰ的相对校正因子的影响，结果显示各成分相对校正因子的RSD% < 1.25%，表明不同高效液相色谱仪及不同色谱柱对各成分相对校正因子无显著性影响。

3.6. 待测组分色谱峰的定位

采用相对保留时间作为定位标准，取“3.2.1”项下对照品溶液，在“3.1”项色谱条件下进样测定，以人参皂苷Rb₁为基准峰，结果显示各成分相对保留时间的RSD < 2.70%，表明在不同的色谱系统及色谱柱下有良好的重现性。

3.7. EMS与QAMS法测定结果的比较

取15批三七血伤宁散，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液；分别精密吸取供试品溶液10 µL，按“3.2”项下色谱条件进样，测定峰面积。采用外标法(ESM)和QAMS法分别计算三七血伤宁散中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅰ的含量，结果见表2。经计算得15批样品两种测定结果的相对偏差在±3.00%以内，表明两种方法无明显差异 [6]。

Table 2. QAMS method compared with the external standard method

表2. 一测多评法与外标法测定结果比较

4. 讨论

文献研究显示，三七中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rd可能是三七活血及发挥消肿定痛作用的物质基础 [7] [8] [9]，另有研究根据谱–效关系筛选出人参皂苷Rg₁还具有止血活性 [10]。这也正阐释了三七“活血不留瘀，止血不伤正”的内涵。重楼中皂苷以重楼皂苷VII、重楼皂苷I等为主 [11]，小鼠实验显示重楼皂苷I、VII具有明显的镇痛作用 [12] [13]，临床上重楼皂苷I、VII主要治疗功能性子宫出血等 [14]。这些成分的药理活性与三七血伤宁散的功效有一定的相关性，适合用于三七血伤宁散质量标准评价的指标性成分。在本实验研究的皂苷类成分中，人参皂苷Rb₁含量高、出峰时间居中，杂质干扰小，而且Rb1化学性质稳定，相对来说价廉易得，因此，选择人参皂苷Rb₁作为内标参照物建立QAMS含量测定方法。

试验对供试品的制备方法进行了单因素考察，考察了提取方式(超声、回流)、提取时间(30 min、45 min、60 min)、提取溶剂(甲醇、70%甲醇、95%乙醇)的影响，确定以20 ml甲醇超声提取30 min，峰分离较好且杂质峰干扰较少。试验参考2020版《中国药典》三七总皂苷含量测定及文献 [15] [16] [17] 有关皂苷的含量测定方法，考察了乙腈–水、乙腈–0.01%磷酸两种流动性体系对三七血伤宁散分离效果，结果显示乙腈–0.01%磷酸系统引入新的杂质，乙腈–水系统的分离效果好，获得的色谱图基线平稳，因此选择乙腈–水系统。

本实验考察了液相、色谱柱、流速、柱温、波长对相对校正因子的影响，结果显示这些因素的改变对相对校正因子的影响较小，表明此方法具有较高的耐用性。并采用QAMS法与ESM法分别测定15批三七血伤宁散中5种成分，结果表明2种方法测得结果没有显著差异，并且由于复方制剂所含成分较多，多成分同时测定已成为复方制剂质量评价的发展趋势，本文首次建立了同时测定三七血伤宁散中5种皂苷类成分的方法，该方法操作便捷，结果准确，为全面评价三七血伤宁散的整体质量提供了实验支持。

基金项目

广西科技重大专项：广西创新驱动发展专项资金项目(合同编号：桂科AA19254026)。

参考文献

NOTES

^*共一作者。

^#通讯作者。