1. 引言
芡实是种植在水域里的植物的果实，因为成熟的芡实外面形似鸡头且带刺，因此又被称为“鸡头米”，可供食用的是这里面的种仁。去除果壳后的芡实为白色，煮熟后果肉较有弹性，具有独特的清淡的香气、口味微甜，一般都是用于清煮、煲汤和煮粥来食用。同时，芡实也是一种中药材，在古代就已经被发现可以补气、滋养脾胃、治疗腹泻和补肾等，在一些流传的中草药书籍中可查寻到芡实的踪迹 [1]。
芡实具有丰富的营养成分，其含有大量的淀粉，但脂肪和糖分含量很低。芡实中主要的活性成分有黄酮类物质和多酚类物质 [2]。芡实的蛋白质和氨基酸的含量较高，氨基酸的种类丰富，不仅具有人体必需氨基酸，还有十几种非必需氨基酸 [3]。芡实的维生素含量也非常丰富，其中Vc的含量可以达到50 mg/kg左右，不亚于其他蔬菜的含量 [4] [5] [6] [7]。因此，人们在日常生活中食用芡实是完全安全且非常健康的，芡实啤酒是有很好的发展前景的。
2. 材料和方法
2.1. 试验材料
芡实粉，取自安徽滁州的干制芡实；麦芽粉，山东天久生物技术有限公司；α-淀粉酶，山东科隆特酶制剂有限公司；糖化酶，无锡市雪梅酶制剂科技有限公司；酒曲，安琪酵母股份有限公司；碳酸钠(AR，国药集团化学试剂有限公司)。
2.2. 试验方法
2.2.1. 糖化率的测定
使用手持糖度折光仪测量糖化液的糖度，该折光仪的测定原理是：溶液中的可溶性固形物的含量与折光率按照一定比例转化，可直接读数得到液体的糖化率。将糖化结束后的混合液进行离心，取澄清液滴在折光仪镜片上，观察读数。
2.2.2. 啤酒花的添加
将麦汁煮沸，在初沸的10 min时加入酒花的15%，煮沸后45 min时加入酒花的45%，剩余的酒花在煮沸结束后加入 [8]。酒花添加的总量为麦汁质量的0.05%，麦汁需煮沸60 min，该实验为了更多的保留芡实的独特风味，减弱酒花赋予啤酒的苦味，采取只添加前两次酒花的方式 [9]。
2.2.3. 成品啤酒各指标的测定
1) 酒精度的测定
发酵后的啤酒用旋转蒸发仪蒸馏出酒精，冷却至20℃后再使用酒精计测量，读数后查表确定酒精度。
2) 色度的测定
根据GB/T 4928-2008，使用可见分光光度计进行测定，以水为空白管来调零，分别在430 nm和700 nm处测定啤酒的吸光度。再以公式将吸光度转化为色度。
2.2.4. 单因素试验
1) 料液比
按照麦芽粉:大米粉 = 1:2，芡实添加量为25%，在90℃条件下添加0.4%的α-淀粉酶糊化10 min，高温灭酶5 min后冷却至60℃时加入0.4%的糖化酶，糖化1 h后灭酶、冷却、离心，分别测定料水比为1:2，1:2.5，1:3，1:3.5，1:4的糖化率。
2) 芡实含量
按照料液比为1:2.5，麦芽粉与大米粉比例不变，在90℃下添加0.4%的α-淀粉酶糊化10 min，糖化酶量为0.4%，在60℃下糖化1 h，高温灭酶5至10 min，冷却后离心，分别测定20%、25%、30%、35%、40%芡实含量的糖化率。
3) α-淀粉酶添加量
按照料液比为1:2.5，芡实含量为30%，麦芽粉与大米粉比例不变，α-淀粉酶添加量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，在90℃下糊化10 min，灭酶后冷却至60℃时添加0.4%的糖化酶，糖化1 h后高温灭酶，分别测定糖化率。
4) 糊化pH
按照料液比为1:2.5，芡实含量为30%，调节pH分别为5、5.5、6、6.5、7，加入0.4%的α-淀粉酶量，在90℃保温糊化10 min，灭酶后冷却至60℃时加入0.4%的糖化酶，糖化1 h灭酶、冷却、离心，分别测定糖化率。
5) 糊化温度
按照料液比为1:2.5，芡实含量为30%，添加最佳的α-淀粉酶量，分别在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃恒温糊化10 min。冷却至60℃时加入0.4%的糖化酶，糖化1 h后灭酶、冷却和离心，分别测定糖化率。
6) 糊化时间
按照料液比为1:2.5，芡实含量为30%，调节pH为5.5，分别在90℃下糊化10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，保持其余条件均不变，分别测定糖化率。
7) 糖化酶添加量
原料和糊化单因素均以最优水平保持不变，分别以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的糖化酶添加量，在60℃下糖化1 h。分别测定糖化率。
8) 糖化pH
分别调节pH为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5在60℃下糖化1 h，其余条件均为各因素的最优水平。分别测定糖化率。
9) 糖化温度
分别在35℃、45℃、55℃、65℃、75℃下糖化1 h，其余水平依旧保持最佳水平，分别测定糖化率。
10) 糖化时间
保持其它因素水平为最佳水平不变，分别糖化30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，糖化结束分别测定糖化率。
11) 酵母接种量
以各因素的最佳水平为基础制备醪液，糖化后灭酶、冷却，分别以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的量称取酵母，分别将酵母在35℃的温水中活化20 min左右，接种在煮沸后的原汁中，在25℃下发酵4天，发酵结束后使用旋转蒸发仪蒸馏出酒精，冷却后再用酒精计测读出酒精度。
12) 发酵时间
以各因素的最佳水平为基础制备醪液，在25℃下分别发酵3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，发酵完成后蒸馏，测定酒精度。
13) 发酵温度
以各因素的最佳水平为基础制备醪液，分别在20℃、25℃、30℃、35℃的恒温箱中发酵四天，发酵后蒸馏并测定酒精度。
2.2.5. 正交实验
分析各单因素的结果，选择结果差异较大的几个单因素，分别以最优水平为中心点，向两边选取梯度做正交实验，确定较优的芡实啤酒酿造方案。
2.2.6. 感官评价
Table 1. Sensory evaluation scoring standard table
表1. 感官评价评分标准表
将发酵好的产品，进行过滤。邀请至少10名同学在同时间段分别对9个样品进行打分，分别将9个不同的样品装在透明的杯子中，以便感官评价的同学观察啤酒，评价标准和分数详见表1。最后，将10个分值取平均值作为最后的评定依据。
3. 结果与讨论
3.1. 各单因素对糖化率的影响
Figure 1. The effect of each single factor on saccharification rate
图1. 各单因素对糖化率的影响
图1(A)显示，随着体系中水含量的增加，糖化率逐渐降低，由于料水比为1:2时的反应体系过于浓稠，操作不方便；而1:3、1:3.5和1:4组的糖化率又偏低，会影响酵母的作用。因此，选取料液比为1:2.5为最佳水平。
图1(B)显示，芡实含量为30%时糖化率最高，五个不同芡实含量对糖化率的结果影响较小，考虑芡实的价格对啤酒成本的影响和糖化率对后续发酵度的影响，最终考虑选择30%为最优水平。
图1(C)显示，α-淀粉酶的添加量对糖化率的影响，一开始呈现上升的趋势，但添加量超过0.3%后，糖化率又逐渐降低，但糖化率的差别不是很大，因此可以判定α-淀粉酶的最佳添加量为0.3%。
图1(D)显示，从60℃至90℃时，糖化率逐渐增长，但100℃时的糖化率又开始降低。从80℃至100℃时糖化率相差甚小，90℃为最佳的糊化温度，100℃时酶在高温下活性降低。
图1(E)显示，糊化时间在30 min时的糖化率最高，糊化时间短或较长都会让糖化率降低。这可能是因为糊化时间在30 min以前，原料中的淀粉不断被水解，糖度不断增高，而时间超过30 min后，淀粉酶长时间在高温环境发生钝化和低分子糖生成焦糖等物质，使得糖化率下降。
图1(F)显示，在pH5.5时糖化率最高，但pH越高，糖化率逐渐降低。糊化时起到作用的主要是α-淀粉酶，酶制剂均有较优的作用pH范围，因此这样的结果可能是因为本实验使用的α-淀粉酶在pH5.5左右活性最强。
图1(G)显示，在糖化酶添加量为0.4%时糖化率最高，糖化酶添加量超过0.5%时糖化率降低，这可能是由于达到一定的糖度时抑制了糖化酶的作用，反而使得醪液糖度偏低 [10]。糖化酶的作用是将淀粉转化为葡萄糖，从而提高醪液的糖度，提高啤酒的发酵度。
图1(H)显示，pH5.5时糖化率最高，这是由于糖化酶在pH5.5的一定范围内活性最强，而pH高于和低于5.5时，糖化酶的活性受到抑制，从而使得糖化率较低。
图1(I)显示，随着糖化时间的增加，在一定范围内糖化率也呈增长的趋势，但时间超过50 min时，糖化率逐渐降低。糖化时间过长，酶制剂的活性降低，使得糖化率变低。
由图1(J)可知糖化的最佳温度为65℃，这主要取决于糖化酶的最佳作用温度。糖化酶在较低温度下活性较低，但温度过高又会被抑制活性，使得糖化率降低。
3.2. 各单因素对酒精度的影响
图2(A)显示，酵母的最佳接种量为0.4%，酵母接种量过低时，则导致发酵周期边长，在设定的发酵时间里酵母利用糖较少，导致酒精度较低。而酵母接种量太多时，大量的酵母需要消耗溶液中的碳源来生存，从而导致醪液中的糖分未完全参与发酵成酒精，使得酒精度低 [11]。
图2(B)显示，在相同的发酵时间下，随着发酵温度的升高，酒精度也逐渐增加。这可能是由于该温度区间在酵母的最适作用范围内。综合考虑芡实啤酒的酒精度要求，25℃应为较佳的发酵温度。
图2(C)显示，在发酵天数为6 d时酒精度最高，但这不适合啤酒的酒精度要求。相反，发酵天数在3 d、4 d时的酒精度是比较适合的酒精度。因此，本实验的较适发酵天数应为3至4 d。
Figure 2. The effect of each single factor on alcohol content
图2. 各单因素对酒精度的影响
3.3. 正交实验结果与分析
Table 2. Orthogonal experiment result table
表2. 正交实验结果表
根据表2正交实验得到的数据，使用DPS数据处理软件进行处理。因啤酒的酒精度不能过高、芡实啤酒应为淡色啤酒，即色度为2~14。综合考虑啤酒的口味不宜过甜。最终确定最优的因素为：糖化55 min，酵母添加量为0.4%，在31℃下恒温发酵3 d。
3.4. 感官评价结果
Table 3. Sensory evaluation results
表3. 感官评价结果表
由表3的感官评价总分可知，确定最受人喜爱的芡实啤酒是8号，8号芡实啤酒透明度高、色泽淡黄澄清、香气较浓且无异味、泡沫也比较丰富，口感微苦有点甜。
4. 结论
本研究通过多种单因素实验和正交试验，分别对芡实啤酒进行糖度、酒精度、色度和感官评价的测定，最终分析得出最优的发酵工艺条件。发酵成熟的芡实啤酒酒精度为11.5˚P，色度为9.84，糖度为16%，啤酒的香气适宜，口感受到多数人的喜爱。
基金项目
滁州市科技计划项目(2020ZN013)。
NOTES
*通讯作者。