1. 引言
三阴性乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体-2的表达均为阴性的乳腺癌，约占所有乳腺癌病理类型的15%~20% [1]。三阴性乳腺癌的预后差、复发转移率高、死亡率高，已成为近年来乳腺癌研究和关注的焦点 [2]。目前针对乳腺癌的治疗手段包括手术治疗、新辅助化疗、辅助化疗、内分泌治疗和靶向治疗等 [3]。因此，三阴性乳腺癌的早期诊断和及时有效的治疗是提高其5年生存率的关键 [4] [5]，所以寻找敏感而特异性强的分子标志物、明确治疗的分子靶点以及正确的进行预后评估则是至关重要的任务。
miRNA是一类机体内源性表达的、长度在18~25个核苷酸的非编码小分子RNA，具有时空特异性，并参与基因转录后水平的调控，它通过与靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)不完全或完全互补配对，而引起靶mRNA的翻译抑制或降解 [6]，这些仅占人类基因1%的miRNA分子，却调控着人类三分之一以上基因的表达、修饰、转录和翻译的过程 [7]，因此，miRNA的发现可能成为极有应用价值的分子标志物，为恶性肿瘤的早期诊断和预后评估开启了一条新的道路。miRNA-200c是miRNA-200家族中最典型的明星分子，在胃癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌等中低表达，与肿瘤的淋巴结转移、组织学分级等相关 [8] [9] [10] [11]；E-cadherin是一种相对分子质量为120,000，依赖Ca2+的跨膜糖蛋白，其主要在上皮细胞表达，是上皮细胞间彼此连接的重要蛋白 [12] [13]，其胞质尾部与α、β、γ和P120-catenin相互作用，构成E-cadherin-catenin复合物，复合物的稳定性及其与肌动蛋白纤维的连接形成黏附连接的核心，这对抑制单个上皮细胞的运动性和保持组织结构的稳态至关重要。大量研究证明E-cadherin的表达与肿瘤的侵袭、浸润、转移相关 [9] [11] [14]。
本项目用Realtime PCR检测miRNA-200c和E-cadherin在三阴性乳腺癌及其配对的癌旁正常组织中的差异表达，探索其表达与三阴性乳腺癌临床病理参数的相关性，用Spearman秩相关检测两者表达相关性，明确其在三阴性乳腺癌的发生、进展中的作用，为肿瘤的研究及治疗开辟新途径。
2. 材料与方法
2.1. 材料
选取2018年1月~2019年1月在武汉科技大学附属孝感医院进行手术并病理检查证实为TNBC的60例患者的组织及完整病例资料，同时选取60例切除肿瘤标本周围正常乳腺组织(距肿瘤边缘 ≥ 5 cm)作为对照组，所有的组织切下来后放入−80℃的冰箱保存，用于提取总的RNA。所有患者均为女性，年龄23~70岁，中位年龄50.4岁；患者术前均未进行新辅助化疗；所有患者免疫组织化学检测ER、PR及HER-2为阴性；对免疫组织化学检测HER-2为阳性(++)的患者同时进行FISH检测，排除HER-2阳性患者。临床分期：I期28例，II期23例，III期9例；组织学分级：I级28例，II级20例，III级12例；腋窝淋巴结转移患者21例，无淋巴结转移39例；Ki-67高表达46例，低表达14例。本研究通过医院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。
2.2. 方法
2.2.1. 提取总的RNA
取100 mg组织放入液氮预冷的研钵中，将组织块迅速研磨成粉末，加入1 ml Trizol在1.5 ml离心管中充分匀浆，室温静置5 min；加入0.2 ml氯仿，振荡、静置、离心、取上清，再加入加入乙醇，萃取RNA，再用260 nm波长分光测定RNA浓度。
2.2.2. 试剂及仪器
实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂购 自上海捷瑞生物工程有限公司，Prime Script反转录试剂盒、TRIzol试剂为日本TaKaRa公司产品，ABI7500 PCR仪为美国ABI公司产品，DNA Marker购自上海捷瑞生物工程有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，SYBR Green I染料、RG-BOX紫外凝胶成像系统为美国Gene公司产品，ND-2000微量核酸定量仪购自美国Thermo Fisher公司；
2.2.3. cDNA的制备
取总RNA 2 μl，用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit试剂盒)和随机引物合成cDNA。反转录反应体系：5 × Prime Script缓冲液4 μl，Prime Script反转录酶I 1 μl，反转录Primer Mix 1 μl，RNA 2 μl，随机6核苷酸引物1 μl， RNase Free dH2O补至20 μl；反转录反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保持。将反转录得到的cDNA −20℃保存备用。
2.2.4. miRNA-200c和E-Cadherin的表达
采用实时荧光定量PCR法(ABI 7500 PCR系统)检测miR-200c、E-cadherin mRNA表达水平，反应条件为95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s共40循环。引物序列：miR-200c，F为5'-CCATGTGCTGGTGTGTGAA-3'，R为5'-TGTGTTTTAGTTCAATGATGATCCA-3'；内参β-actin，F：5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3'；R：5'-GCTAGGAGCCAGGCAGTAATCT-3'；E-cadherin，F：5'-AAGTGCTGCAGCCAAAGACAGA-3'；R：5'-AGGTAGACCCACCTCAATCATCCTC-3'，内参β-actin，F：5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3'；R：5'-GCTAGGAGCCAGGCAGTAATCT-3'；扩增完成后按仪器默认条件进行溶解曲线分析，为确定反应一致性，每次PCR重复3次。数据用RQ = 2−ΔΔCt表示相对定量结果，以U6作为内参，每个组织，样本独立实验三次。ΔCt = [Ct(miRNA) − Ct(U6)]或者[Ct(E-cadherin) − Ct(β-actin)]，ΔΔCt = [ΔCt(癌) − ΔCt(正常)]，2−ΔΔCt表示癌组织中的miRNA相对于正常组织的倍数差异，即miRNA在两组表达的相对差异。
2.2.5. 统计学原理
所有数据使用SPSS23.0软件进行。独立样本t检验分析TNBC及癌旁正常组织中miRNA-200c和E-cadherinmRNA的表达差异。以平均表达值作为截点将三阴性乳腺癌组织中miRNA-200c和E-cadherinmRNA的表达分为低表达组和高表达组，用卡方检验分别分析miRNA-200c和E-cadherin mRNA表达与临床病理指标的关系。Pearson相关系数检测结肠癌组织中miRNA-200c和E-cadherin mRNA表达的相关性，所有统计以P < 0.05有统计学意义。
3. 结果
3.1. 评价指标
miRNA-200c、E-cadherin以及内参β-actin的扩增效率各自生成，三基因扩增效率均为R2 > 0.995。三个基因扩增产物的溶解曲线均都只有一个峰，有很好的特异性，PCR产物均在高于84℃以上获得单一溶解峰，确定为目的产物。
3.2. miRNA-200c和E-Cadherin在不同组织中的表达比较
60例TNBC及癌旁正常组织中miRNA-200c、E-cadherin表达分别进行检测，结果表明与正常组织相比，miRNA-200c、E-cadherin在中表达TNBC明显降低，且差异具有统计学意义(P < 0.05，见图1)。
Figure 1. Expression of miRNA-200c and E-cadherin in TNBC and adjacent normal tissue
图1. miRNA-200c和E-cadherin在TNBC和癌旁正常组织中的表达
3.2. miRNA-200c和E-Cadherin在TNBC中的表达与临床病理学关系
分别以miRNA-200c和E-cadherin的平均表达值作为截断值，将表达值分为高表达组和低表达组得到计量资料。miRNA-200c和E-cadherin在TNBC中呈低表达，其表达值显著低于癌旁正常组织(P < 0.05，见表1)；另外，miRNA-200c和E-cadherin的表达与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移、分期显著相关(P < 0.05，见表2)，而与患者的年龄、肿瘤大小、KI-67无显著相关性(P > 0.05，见表2)。
Table 1. Expression of miRNA-200c and E-cadherin in TNBC and adjacent normal tissues
表1. miRNA-200c和E-cadherin在TNBC和癌旁正常组织中的表达
Table 2. Relationship between miRNA-200c and E-cadherin expression and clinicopathology
表2. miRNA-200c和E-cadherin的表达与临床病理学之间的关系
3.3. miRNA-200c和E-Cadherin在TNBC中的表达的相关性
应用Pearson相关系数对TNBC中miRNA-200c和E-cadherin表达水平进行相关性分析，结果显示两者呈显著正相关(r = 0.521, P < 0.05)。
4. 讨论
肿瘤的发生及进展是多基因、多阶段的病理过程，转移是肿瘤的最恶性特征体现，也是肿瘤患者最主要死亡原因 [15]；肿瘤的进展过程包括上皮–间质转化(EMT)，基底膜的降解，肿瘤血管生成，肿瘤细胞迁移等过程，其中上皮间质转化在肿瘤的起始阶段起重要作用。
目前，研究表明miRNA在细胞增殖及侵袭、B细胞存活、胰腺分泌胰岛素、肿瘤发生及进展、转移方面研究是目前的热点。在乳腺癌中，miRNA在乳腺癌的发生、增殖、侵袭、转移中起着重要的作用 [16] [17] [18] [19]。miRNA-200 family又是miRNA中研究的热点，miRNA-200 family包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-429五个成员 [20]，miRNA-200家族在许多恶性肿瘤中存在差异表达，并与恶性肿瘤的临床病理参数相关，可用来指导病情评估及预后预测。来自意大利的Ceppi P [21] 等研究miRNA-200c在非小细胞肺癌中的表达及意义，结果显示：与正常组织相比，miRNA-200c在癌组织中的表达水平显著降低，且与组织分级、淋巴结转移呈负相关；Paterson EL [22] 等研究miRNA-200c结直肠癌中的表达情况，结果显示miRNA-200c在结直肠癌间质浸润早期呈表达下调，而在已经发生转移的部位呈高水平表达；miRNA-200c在胃癌、前列腺癌、卵巢癌等 [23] [24] [25] 肿瘤中均呈低表达，与肿瘤的淋巴结转移及肿瘤分期、组织学分级相关。本研究结果与上述研究一致，miRNA-200c的表达与TNBC的组织学分级、淋巴结转移、肿瘤分期相关(P < 0.05)，肿瘤的淋巴结转移越多、分期越晚，肿瘤组织学分级越高，miRNA-200c表达越低，与肿瘤的大小、KI-67表达、患者年龄等没有显著关系；另外，Paterson E. L.等研究已经证明miRNA-200c可以阻止上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的改变，而EMT是肿瘤发生转移的基础 [26] [27] [28]，鉴于此，我们可以推测miRNA-200c在三阴性乳腺癌发生及进展中可能扮演着重要作用。
E-cadherin是由cdh1基因转录成的依赖Ca2+的跨膜糖蛋白，其主要在上皮细胞表达，是上皮细胞间彼此连接的重要蛋白 [12] [13]。大量研究证明，E-cadherin在肿瘤的进展中减少及缺失，与肿瘤的淋巴结及远处转移密切相关 [14] [29] [30]。本研究与以上研究结论一致，E-cadherin的表达与TNBC的组织学分级、淋巴结转移、肿瘤分期相关(P < 0.05)，与肿瘤的大小、KI-67表达、患者年龄等没有显著关系，我们发现肿瘤的淋巴结转移越多、分期越晚，肿瘤组织学分级越高，E-cadherinmRNA表达越低，我们推测E-cadherin在三阴性乳腺癌发生及进展中起负调节的重要作用。
另外，miRNA-200c和E-cadherin两者表达在TNBC中呈正相关，表明两者表达具有一致性，两者的表达均与肿瘤的分期、淋巴结转移、组织学相关，肿瘤的分期越高、淋巴结转移越多及组织学分级越高，两者蛋白表达强度越低，表明两者在肿瘤的转移中起重要的负调节作用，可能的机制是miRNA-200c通过调控E-cadherin的表达，引起肿瘤组织中钙粘蛋白表达降低，肿瘤紧密连接减少，肿瘤可以迅速向外转移；另外，肿瘤分化越低，肿瘤的侵袭性及越强，与周围组织连接越少，越容易向外浸润转移。
总之，miRNA-200c和E-cadherin可能均参与肿瘤进展，两者的表达与肿瘤的分期、淋巴结转移、组织学相关，属于肿瘤负调节分子，miRNA-200c可能通过调节E-cadherin的表达发挥作用，有待进一步实验研究。
基金项目
孝感市自然科学基金(XGKJ2019010014)。
NOTES
*通讯作者。