摘要: 目的：研究非受体酪氨酸激酶Fyn在原发性胆管细胞癌组织中的表达情况，分析Fyn与临床病理参数之间的关系及其和患者预后的关系。方法：收集113例胆管细胞癌患者的临床资料和病理标本，通过免疫组织化学染色法(免疫组化)检测患者肿瘤组织Fyn中的表达情况，分析患者的临床病理特征，采用卡方检验分析Fyn与临床病理参数之间的关系。Kaplan-Meier法绘制患者生存曲线，Log-rank检验和Cox比例风险模型分析患者预后及影响因素。结果：Fyn的表达水平与肿瘤直径、N分期、组织分化程度有相关性，差异具有统计学意义(P < 0.05)。Fyn高表达患者的总生存期(0S)较Fyn低表达患者短(P < 0.05)。多因素Cox比例风险模型分析显示，高Fyn表达、高龄、组织分化程度低、淋巴结转移皆为影响OS的独立危险因素。结论：癌组织中Fyn的表达会影响胆管癌患者预后，Fyn可能成为胆管癌患者临床诊疗过程中新的观察指标及治疗靶点。
Abstract:
Objective: To study the expression of non-receptor tyrosine kinase Fyn in primary cholangiocarci-noma tissues, and to analyze the relationship between Fyn and clinicopathological parameters and its relationship with patient prognosis. Methods: Clinical data and pathological specimens of 113 patients with cholangiocarcinoma were collected, and the expression of Fyn in tumor tissues of pa-tients was detected by immunohistochemical staining (immunohistochemistry) to analyze the clinicopathological characteristics of patients, and the relationship between Fyn and clinicopatho-logical parameters was analyzed by the chi-square test. The Kaplan-Meier method was used to plot the survival curves of patients, and the Log-rank test and Cox proportional risk model were used to analyze patient prognosis and influencing factors. Results: The expression level of Fyn correlated with tumor diameter, N stage, and tissue differentiation, and the difference was statistically signifi-cant (P < 0.05). The overall survival (0S) of patients with high Fyn expression was shorter than that of patients with low Fyn expression (P < 0.05). Multifactorial Cox proportional risk model analysis showed that high Fyn expression, advanced age, low tissue differentiation, and lymph node metas-tasis were independent risk factors for OS. Conclusion: Fyn expression in cancer tissues affects the prognosis of cholangiocarcinoma patients, and Fyn may become a new observational index and therapeutic target in the clinical treatment of cholangiocarcinoma patients.
1. 引言
近年来，原发性胆管细胞癌(简称胆管癌)总发病率在全球范围内保持递增趋势，成为全球继肝细胞癌之后，第二常见的肝胆系统恶性肿瘤 [1] [2]。胆管癌(cholangiocarcinoma)是胆管系统中衬覆上皮所发生的恶性肿瘤，其累及肝内、肝门周围和远端胆道。按肿瘤所发生的部位可分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)和肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma, ECC)两大类。与肝细胞癌生物学行为不同是胆管癌更容易浸润胆管壁并侵犯到周围肝组织、血管、神经、淋巴组织，所以手术切除率很低，患者总的预后较差。大多数早期胆管癌患者是没有症状的，且胆管癌病理特点是高度促结缔组织增生，细胞分布稀疏，会降低细胞学和病理学诊断方法的敏感性。故胆管癌的早期诊断仍然是一个较大的挑战，仅少数患者能够早期发现并接受根治性手术，而手术是唯一能够根治胆管癌的方法，是延长胆管癌患者生存期的最有利治疗方法 [3] [4] [5]。但手术治疗后的长期存活率并不理想，因为约5%的胆管癌是多病灶，50%的患者有淋巴结转移，10%~20%的患者有远处转移 [6]。Src家族激酶是由Src家族基因编码的非受体型蛋白酪氨酸激酶。作为Src家族的重要成员之一，酪氨酸激酶Fyn近年来受到了广泛关注，其蛋白表达水平或催化活性水平的异常升高，可参与多种肿瘤细胞的分化、增殖、迁移、血管生成 [7] [8]。研究发现Fyn在多种肿瘤组织中如乳腺癌 [9]、颅脑肿瘤 [10]、胰腺癌 [11] [12]、前列腺癌 [13] 等表达水平增高，并且Fyn表达升高可以促进肿瘤发展。但目前并没有Fyn在胆管癌表达与预后关系的相关研究，此研究可填补这一领域的空白。
2. 材料与方法
2.1. 研究对象
本研究选取2015年6月至2017年6月在青岛市市立医院东院区肝胆外科行胆管癌根治术共计113例胆管癌患者，纳入标准包括均为术后患者，且未行新辅助放化疗、靶向治疗、免疫治疗等，符合胆管细胞癌的诊断且具有明确的病理学诊断；患者能够完成完整的随访；排除标准：病理诊断为原发性肝细胞肝癌或者合并有其他恶性肿瘤的患者；手术前接受新辅助放化疗或相关抗肿瘤药物治疗的患者；术后30天内死亡的患者；随访期间失访者。随访时间截止到2022年6月。患者或其授权的家属均已签署知情同意书，本次研究获得了青岛市市立医院伦理委员会的许可。
2.2. 检测方法
1) 均采用免疫组织化学过氧化物酶连接(SP)法进行检测。
2) 胆管细胞癌中Fyn的表达检测方法
选择待测蜡块，制作厚度为4 μm的常规组织切片，68℃温箱烤片30分钟。经二甲苯脱蜡操作4次，梯度酒精脱水操作4次，浸泡于蒸馏水中水洗1分钟。用EDTA修复液在高压(100℃，2分钟)下修复组织抗原，取出冷却至室温。PBS洗涤3次。3% H2O2室温下孵育10分钟。PBS洗涤3次。加入山羊血清，在室温下孵育20分钟。滴加一抗工作液(重组Anti-Fyn抗体[EPR19636] ab184276，1:50，Abcam)、于37℃恒温孵育1小时。PBS洗涤3次。滴加二抗(酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，于室温下孵育15分钟。PBS洗涤3次。使用DAB显影剂控制显微镜下的染色。用蒸馏水冲洗1分钟，苏木素复染，梯度酒精脱水操作3次干燥，二甲苯3次透明，中性树胶封片。
3) 结果判读
Fyn的表达的结果判读由两位职称均为副主任医师以上的资深病理学专家采用双盲法独立评估所有的病理染色切片。当两位医师评估结果不一致时，则由第三位病理科主任医师重新进行计数并分组。在肿瘤细胞膜和细胞质上出现黄色至棕褐色颗粒，判读为阳性，首先在低倍镜下观察切片全部视野，而后随机选取10个中倍镜视野(200倍)进行观察。表达水平由染色强度和分布决定。染色强度分级：无着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分；阳性细胞的分布定义为：<5%为0分、5%~25%为1分、26%~50%为2分、51%~75%为3分、>75%为4分，两项结果相乘得到免疫组化评分：0~1分为阴性、2~4分为弱阳性、5~8分为中阳性、9~12分为强阳性。为了确定Fyn表达是否与临床病理特征相关，将Fyn在肿瘤细胞上的表达水平是阴性与弱阳性定义为Fyn低表达组，表达水平是中阳性及强阳性定义为Fyn高表达组。
2.3. 统计学处理
统计学分析应用SPSS 23.0软件进行。癌组织中Fyn表达与各临床病理参数的数据分析比较采用卡方检验。采用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线，log-rank检验法分析Fyn表达与患者总生存期(OS)之间的关系。采用Cox比例风险模型来确定各变量对OS的影响。P < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. Fyn的表达情况
Fyn主要表达于肿瘤细胞膜及细胞质中。在胆管癌组织中，Fyn高表达63例，低表达50例。在纳入研究的胆管癌组织中，Fyn高表达63例，低表达50例。癌组织中Fyn阳性表达见图1，癌组织与癌旁组织中Fyn表达差异见图2。
Figure 1. Fyn positive expression in cancer tissues
图1. 癌组织中Fyn阳性表达
Figure 2. Difference of Fyn expression between cancer tissues and adjacent tissues
图2. 癌组织与癌旁组织中Fyn的表达差异
3.2. Fyn的表达与临床病理学参数的关系
统计学分析表明，癌组织中Fyn的表达水平与肿瘤直径、N分期、组织分化程度有关，差异具有统计学意义(P < 0.05)。与性别、年龄、术前ALT、AST水平、病理类型等因素没有相关性，差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1。
Table 1. The relationship between Fyn expression and clinicopathological parameters
表1. Fyn的表达与临床病理参数的关系
3.3. Fyn与患者预后的关系
Fyn高表达组中，在随访过程中，有11例删失数据，其中3例患者退出研究，6例患者失访，2例患者因研究时限已到而停止观察。Fyn高表达者OS平均值为32.950个月，中位生存时间为33个月。Fyn低表达组中，有10例删失数据，其中6例失访患者，1例患者退出研究，3例患者因研究时限已到而停止观察。Fyn低表达者患者OS平均值为39.796个月，中位生存时间为36个月。统计学分析表明，Fyn低表达患者OS高于Fyn高表达患者，差异具有统计学意义(P < 0.05)。结果显示，Fyn低表达患者预后较高表达患者好。见图3、表2。
Figure 3. Effect of Fyn expression on OS of patients
图3. Fyn表达情况对患者OS的影响
Table 2. Effect of Fyn expression on survival time of patients with cholangiocarcinoma
表2. Fyn表达情况对胆管癌患者生存时间的影响
Log-rank检验提示Fyn的表达水平与患者预后相关，差异有统计学意义(P < 0.05)。
在完成随访的102名患者中，采用Cox比例风险模型确定Fyn与OS的相关性。单变量Cox回归分析显示，Fyn、年龄、N分期、组织分化程度是影响OS的重要预后因素。多变量Cox回归分析显示，这些因素仍然是独立的预后因素。见表3。
Table 3. Univariate and multivariate Cox regression analysis of OS in patients with cholangiocarcinoma
表3. 胆管癌患者OS的单因素及多因素Cox回归分析
4. 讨论
胆管癌是一类具有高度分子多样性和基因异质性的肿瘤。特别是在早期阶段，肿瘤的隐匿性、无症状性、高侵袭性、瘤内和瘤间异质性以及化疗耐药性，严重的影响了化学治疗的疗效，导致预后不佳。胆管癌不同的类型都有不同的流行病学、生物学、预后和临床管理策略，这些异质性同样导致靶向治疗的效果差异巨大。故更深入地了解胆管癌各类型的驱动基因突变对精准治疗意义重大。本研究结果证明Fyn在胆管细胞癌中过表达，并与胆管癌的大小与淋巴结转移和组织分化程度相关，这些结果揭示了Fyn在胆管细胞癌中的促癌作用。
Fyn是Src家族酪氨酸激酶成员之一，在细胞质多聚核糖体上合成，N端豆蔻酰化，然后迅速转移到脂膜上并进行棕榈酰化修饰。Fyn具有广泛的生物学功能，包括通过T细胞受体的信号传递、血小板活化、脑功能的调节(轴突导向、突触功能、神经元分化、中枢神经系统髓鞘形成)以及细胞生长、存活、粘附介导、运动性的信号传递。Fyn可作为治疗中枢神经系统损伤和某些神经退行性疾病潜在靶点，如阿尔茨海默病。更多的研究表明Fyn的上调和转录水平改变与一些恶性肿瘤有关，Fyn过表达会影响细胞生长和增殖，导致形态转化和有丝分裂信号的改变。在外周免疫系统中，Fyn在T细胞和B细胞受体信号传导的调节和功能以及自然杀伤细胞的分化中发挥着重要作用，这表明Fyn可通过影响人体免疫系统进而影响肿瘤的发生发展。有研究表明Fyn在胰腺癌淋巴转移起重要作用 [14]，这和我们的实验结果相吻合。在前列腺癌组织中Fyn的表达能够预测淋巴结转移 [8]，Fyn会增强神经内分泌表型并增加前列腺癌内脏转移几率 [15]。在结直肠癌中，细胞朊蛋白诱导Fyn加速结直肠癌转移 [16]。邵等人证明了Fyn可抑制AMPK/mTOR信号通路，促进胆管癌细胞迁移和侵袭，结果证实，Fyn阻断是抗胆管癌治疗的一个潜在靶点 [17]。
目前的实验中仍然存在局限性。首先虽然长期随访可以增加结果的说服力，但需要对大量患者进行额外的前瞻性研究来证明当前的结论。第二，通过免疫组化法检测出的Fyn表达只针对原始肿瘤组织，并不能反映其在肿瘤微环境相互作用的完整信息。Fyn表达与其他临床病理特征相关性的机制仍然不明确，这会是以后研究的重要方向。我们的研究清楚地证明了Fyn在预测胆管癌患者生存率中的预后价值。不同研究中差异的原因尚不清楚，将来可能仍需要更大的队列来确定Fyn在疾病过程中的积极或消极作用。
目前仍缺乏对胆管癌早期诊断的敏感方法，大量研究表明Fyn不仅是评估预后的有价值的标志物，而且是一个很有前景的治疗靶点，但目前还没有针对Fyn的分子靶向药物获得批准并应用于临床。针对Src家族激酶(Src-familykinase, SFK)的分子靶向药物虽可应用于临床，但这种非特异性靶向治疗是否会损害更多特异性抑制剂可能带来的临床益处，仍有争议。随着对Fyn研究的深入，探讨Fyn在临床工作中的应用前景及相关分子靶向药物研发，可为临床医学提供新的治疗思路和方向。明确Fyn在胆管癌患者癌组织或癌旁组织中的表达及其与患者预后之间的相关性，将对胆管癌患者的预后评估及治疗方向提供新的思路。
NOTES
*通讯作者。