Trim26/ZNF173条件性基因敲除小鼠的制备

Establishment of Trim26/ZNF173 Conditional Gene Knockout Mice

摘要: 目的：制备Trim26/ZNF173条件性基因敲除小鼠，为研究Trim26基因在肝癌发生中的作用及其机制提供动物模型。方法：设计基因敲除策略，Trim26的外显子5~7缺失引起的移码突变会破坏蛋白结构域，进而导致Trim26蛋白功能丧失。为此，我们拟删除Trim26基因的外显子5~7，以借助Cre/lox P系统构建Trim26基因条件性敲除的小鼠。简单地说，先获得嵌合体小鼠，选择高嵌合率小鼠与B6/N小鼠交配获得F1代Trim26^fl/wt基因型的杂合子小鼠。F1代杂合子小鼠自交得到F2代Trim26^fl/fl基因型的纯合小鼠和对照野生型小鼠。提取鼠尾基因组DNA并行PCR鉴定基因型，在DNA水平确定小鼠的基因型。结果：成功构建了打靶载体，打靶载体经限制性内切酶线性化后，成功电转导入了B6/BLU ES 细胞中，ES克隆经过LR-PCR初筛及Southern blot进一步验证，确定得到了3株中靶ES细胞(即3D、6A和10F)，将中靶ES细胞扩增后进行囊胚注射，获得了12只Trim26的嵌合体小鼠(嵌合率不小于50%)。选择性成熟后的高嵌合率小鼠与B6/N小鼠交配繁育，得到F1代小鼠，PCR鉴定基因型确认获得了Trim26^fl/wt基因型的F1代杂合子小鼠。性成熟后的F1代杂合子小鼠合笼交配后得到F2代小鼠，PCR鉴定基因型确认获得了纯合的Trim26条件性基因敲除小鼠(基因型为Trim26^fl/fl)。结论：成功制备了Trim26条件性基因敲除小鼠，为进一步解析Trim26在肝癌发生中的作用及机制打下了良好基础。

Abstract: Objective: To establish the Trim26/ZNF173 conditional gene knockout mice model to lay the foun-dation for further research on the role of Trim26 gene in hepatocarcinogenesis and underlying mechanisms. Methods: Designing gene knockout strategies, the frame-shift mutation caused by the deletion of exon 5~7 of Trim26 will destroy the protein domain, which will lead to the function loss of Trim26 protein. Therefore, we plan to delete exons 5~7 of Trim26 gene to construct Trim26 gene conditional knockout mice with Cre/lox P system. In short, the chimeric mice were obtained first, and then the heterozygous mice (Trim26^fl/wt genotype) of F1 generation were obtained by mating the chimeric mice with B6/N mice. The F2 generation of homozygous mice with Trim26fl/fl genotype was obtained from F1 generation of heterozygous mice by inbreeding. Genomic DNA of mouse tail was extracted and the genotypes of mice were determined at DNA level by PCR. Results: The targeting vector was successfully constructed. The targeting vector linearized by restriction endonuclease was successfully electroporated into B6/BLU ES cells. The targeted ES cell clones were preliminarily screened by LR-PCR and further verified by Southern blot, and three targeted ES cells (3D, 6A and 10F) were obtained. By injecting the targeted ES cells into the blastocysts, 12 chimeric mice were obtained (the chimeric rate was not less than 50%). The F1 generation of heterozygous mice with Trim26^fl/wt genotype was obtained by mating of chimeric mice with B6/N mice. The F2 generation of Trim26 knockout mice with Trim26^fl/fl genotype were obtained by mating with F1 heterozygous mice with Trim26^fl/wt genotype. The genotypes of F1 and F2 generation mice were identified by PCR. Conclusion: Trim26 conditional gene knockout mice were successfully generated, which lays a good foundation for further understanding the roles of Trim26 in hepatocarcinogenesis and underlying mechanisms.

1. 前言

我国原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC，简称肝癌)每年的新发病例占全世界每年新发病例的45%，是名副其实的“肝癌大国” [1]。国家癌症中心在2022年3月最新发布的中国肿瘤现状和趋势报道中显示，肝癌的死亡率在男性和女性均居第二位，在城市和农村肝癌的死亡率均居第二位 [2]。可见，肝癌是严重威胁我国人民生命健康的疾病。然而，肝癌起病隐匿、恶性程度高、早期诊断困难、预后差，70%~80%的肝癌患者在诊断时就为晚期，已丧失手术治疗机会 [3]。虽然手术、介入治疗、靶向治疗和免疫治疗新药在肝癌治疗中取得了一些临床进展，但是目前报道的肝癌五年生存率仅为19.6% [4]。因此，加强肝癌发生分子机制的研究非常重要，通过研究有望筛选出更多的肝癌预防干预和治疗的新靶点 [5]。我们前期的预实验结果显示，Trim26/ZNF173/RNF95在人HCC组织中表达显著下调，Trim26抑制小鼠正常肝细胞增殖，这就提示Trim26表达下调可能与HCC发生相关。因此，我们拟制备Trim26条件性基因敲除小鼠，为下一步研究Trim26基因在肝癌发生中的作用及机制提供动物模型。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

在获得最终Trim26条件性基因敲除小鼠之前，打靶策略、打靶质粒构建、同源重组ES克隆筛选与鉴定、中靶ES细胞囊胚注射获取嵌合体小鼠以及最终获得可遗传的F1代杂合子等工作由南京大学-南京生物医药研究院完成。小鼠饲养于SPF级屏障设施内，设施使用许可证号：SYXK (粤) 2021-0167。实验方案得到实验动物使用管理委员会的批准。

2.2. 主要试剂

Trim26条件性基因敲除打靶载体由南京大学–南京生物医药研究院构建，各种限制性内切酶、T4、DNA连接酶、PCR扩增试剂dNTP和Taq酶、DNA marker、鼠尾基因组DNA裂解液以及Southern印迹相关试剂等购自TaKaRa及NEB公司，质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司，硝酸纤维素膜购自S & S公司，细胞培养所需试剂为Invitrogen公司产品。引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。其余试剂为国产或进口化学纯或分析纯。

2.3. 小鼠ES细胞培养

ES细胞每2~3天按照1:3的比例传代一次。培养ES细胞的培养皿在接种饲养层(即小鼠胚胎成纤维细胞)细胞前先用0.1%明胶处理。传代过程：弃去原培养基，加入1.5 ml 0.25%胰酶消化5 min后，加入含有15%胎牛血清的高糖DMEM培养基中和胰酶反应。然后用吸管轻轻吹打，直至成为单细胞悬液。将单细胞悬液按1:3的比例转移到新的含有饲养层细胞的35 mm细胞培养皿中，补加相同培养基。将细胞悬液摇匀后，放置于5% CO₂、37℃培养箱中培养；每日换液，细胞长满后继续传代。

2.4. ES线性化的打靶载体电转ES细胞以及中靶ES细胞筛选和鉴定

采用电转方法转染ES细胞，其条件参照文献 [6]。构建打靶载体，并使用限制性内切酶线性化打靶载体。然后将线性化的打靶载体，电转入B6/BLU ES细胞中，通过Long Range PCR及Southern blot筛选出正确同源重组的ES克隆。中靶ES克隆经过囊胚注射，最终获得可遗传的F1代杂合子和F2代纯合子。

2.5. 基于小鼠组织基因组行PCR鉴定基因型

提取高质量ES细胞和鼠尾基因组DNA，并将DNA重悬于50 ml TE中，37℃过夜溶解，可用作Southern blot实验。鼠组织基因组DNA粗提：剪鼠尾约0.5 cm放入Ep管中，加入100 ml SA液，置于95℃，50 min。加SB液100 ml于Ep管内，震荡20次，3000 rpm离心10 min，取70 ml上清备做PCR分析。PCR引物(F：Forward，上游引物；R：Reverse，下游引物)详见表1。

Table 1. Primers used for genotype identification by PCR

表1. PCR鉴定基因型所用引物

3. 结果

3.1. Trim26基因敲除方案

锌指蛋白Trim26/ZNF173/RNF95基因是一个核转录因子，定位于6号染色体的主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)区域，基因组含有10个外显子，编码由545个氨基酸构成的蛋白质。Trim26是Tripartite基序家庭成员之一，包含3个锌指结构域、一个RING、一个B-box 1型、一个B-box 2型和一个螺旋-螺旋结构域，其中锌指结构域结合DNA，参与基因表达调控，RING结构域具有E3泛素连接酶的活性，B-box 2结构域也参与蛋白泛素化修饰。

通过对Trim26蛋白结构域的分析发现，外显子5~7缺失引起的移码突变会破坏蛋白结构域，进而导致Trim26蛋白功能丧失。为此，我们拟删除Trim26基因的外显子5~7，以借助Cre/lox P系统构建Trim26基因条件性敲除的小鼠(图1)。

Figure 1. Schematic diagram of the establishment of Trim26 conditional gene knockout mice mediated by Cre/lox P system

图1. 借助Cre/lox P系统建立Trim26条件性基因敲除小鼠的策略示意图

3.2. 筛选和鉴定发生正确同源重组的ES克隆以及嵌合体小鼠获取

按照图1所展示的建立Trim26基因条件性敲除小鼠的方案，构建打靶载体。打靶载体经限制性内切酶线性化后，电转导入B6/BLU ES Cell line中。电转后24小时更换含有G418抗性的培养基进行加压筛选。利用G418筛选可以得到含有新霉素基因(neomycin)的ES细胞，这种细胞发生了打靶载体的插入，但是G418筛选无法排除打靶载体随机整合入基因组进而获得抗性的细胞；在随机插入情况下，打靶载体携带的DTA (白喉毒素(Diphtheria Toxin, DT) A片段)表达，而DTA可以直接杀死细胞，不需要再通过加入Gancyclovirs的方式进行阴性筛选。这样利用以上筛选可以使得中靶细胞得到最大程度的富集。

ES细胞在如上筛选培养基中培养7天后，挑取仍然存活的抗性ES克隆，以进行扩增培养。扩增后的抗性ES细胞克隆分成两份冻存，以备确定中靶细胞序列号后进行扩增培养和后续的囊胚注射；一份用来提取基因组DNA，进行中靶细胞的筛选和鉴定。对挑取的96个克隆通过Long Range PCR策略初筛，得到16株中靶ES细胞(3D、5G、6A、9D、10F、11A、11G、12E、1F、3B、3C、3E、4F、5D、10B和11G) (筛选结果未显示)。接着，经Southern blot进一步验证，确定得到3株中靶ES细胞(即3D、6A和10F) (图2)。

(a)：5'-end筛选；(b)：3'-end筛选；(c)：neo筛选。WT，野生型小鼠的基因组DNA；1~6泳道为样品ES细胞克隆的基因组DNA，1~6泳道分别对应3D、5G、6A、9D、10F和11G样品ES细胞克隆。Southern blot鉴定结果：样品1 (3D)、3 (6A)和5 (10F)为阳性克隆。

Figure 2. The targeted ES cell clones were screened by Southern blot

图2. Southern blot筛选中靶ES细胞阳性克隆

将Southern印迹确证的中靶ES细胞(即3D 6A和10F)复苏，于24孔板内扩增之后，进行囊胚注射，获得12只Trim26的嵌合体小鼠(嵌合率不小于50%) (图3和表2)。

Figure 3. Photo of the chimeric mouse

图3. 嵌合体小鼠照片

Table 2. Details of chimeric mice

表2. 嵌合体小鼠明细

3.3. Trim26基因条件性敲除小鼠获取

选择性成熟后的高嵌合率小鼠与B6/N小鼠交配进行繁育，得到F1代小鼠，并行PCR鉴定基因型，获得Trim26^fl/wt基因型的F1代杂合子小鼠(图4和表3)。

Table 3. Details of heterozygous mice

表3. 杂合子小鼠明细

N，空白对照；B6，野生型小鼠的基因组DNA；P，阳性对照；157~185泳道为样品基因组DNA。基因型鉴定结果：157、161、166、167、169、172、177、181、183和185为杂合子(Trim26^Fl/wt)，其余为野生型(WT)；157、158、160、162~165、167、173、175、176、178、180和182-184为Flper杂合子(Flper^fl/wt)。

Figure 4. Electrophoresis diagram for genotype identification of Trim26^fl/wt mice

图4. Trim26^fl/wt小鼠基因型鉴定电泳图

性成熟后的Trim26^fl/wt基因型的F1代杂合子小鼠合笼交配，得到F2代小鼠，并行PCR鉴定基因型，获得纯合的Trim26条件性基因敲除小鼠(基因型：Trim26^fl/fl) (图5和表3)。

WT，野生型小鼠的基因组DNA；1~8泳道为样品基因组DNA。基因型鉴定结果：样品2和6为纯合子(Trim26^fl/fl)，样品1、4、5和7为杂合子(Trim26^fl/wt)，样品3和8为野生型(WT)。

Figure 5. Electrophoresis diagram for genotype identification of Trim26^fl/fl mice

图5. Trim26^fl/fl小鼠基因型鉴定电泳图

4. 讨论

在传统的基因敲除小鼠模型中，若敲除的基因对生命活动至关重要，则基因被完全敲除后小鼠常出现胚胎致死或出生后不久就死亡的现象，限制了进一步在体内研究所敲除基因的功能 [7]，本文中我们采用的条件性基因敲除技术是基于Cre-LoxP系统介导下的一种位点基因特异性重组技术，借助Cre/lox P系统来删除Trim26基因的外显子5~7，外显子5~7缺失引起的移码突变会破坏蛋白结构域，进而导致Trim26蛋白功能丧失。通过该基因敲除策略，我们获得了基因型为Trim26^fl/fl的纯合的Trim26条件性基因敲除小鼠，该小鼠与组织特异性Cre品系小鼠交配后可获得组织或细胞特异性敲除Trim26的小鼠，该小鼠与全身性敲除Cre品系(如：CMV-Cre)交配后可获得全身性敲除Trim26基因的小鼠，这就使得对小鼠Trim26基因的敲除处于时空可调控的状态，为后续在小鼠体内进一步研究Trim26基因在肝癌发生中的作用及机制奠定了良好的研究基础。

锌指蛋白TRIM26基因是一个转录因子，定位于6号染色体的主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)区域 [8]。Trim26是Tripartite基序家庭成员之一，包含3个锌指结构域、一个RING、一个B-box 1型、一个B-box 2型和一个螺旋–螺旋结构域，其中锌指结构域结合DNA，参与基因表达调控，RING结构域具有E3泛素连接酶活性，B-box 2结构域也参与蛋白泛素化修饰 [9]。目前，为数不多的研究是有关它具有E3泛素连接酶的活性 [10]，在呼吸道疾病 [11]、抗HIV-1感染 [12] 和作为精神分裂症的易感基因 [13] 等方面发挥作用。总之，目前对Trim26的功能还知之甚少。

现有的少量证据表明，Trim26与肿瘤亦有关系。新近研究证实，Mule和Trim26介导的NEIL1泛素化依赖调节参与了细胞DNA损伤反应过程，抑制Trim26的表达后，增强了人骨肉瘤U2OS细胞对放疗的抵抗性 [14]。还有研究结果显示，Trim26在鼻咽癌组织中表达明显下调，且该基因表达下调与鼻咽癌低免疫反应密切相关 [15]；TRIM26在子宫内膜癌组织和子宫内膜癌细胞系中表达下调，TRIM26通过调节AKT通路和凋亡过程，抑制子宫内膜癌细胞增殖 [16]；TRIM26在非小细胞肺癌肿瘤组织和细胞系中都显著下调，TRIM26通过抑制PI3K/AKT通路而抑制非小细胞肺癌细胞增殖 [17]。然而，有研究表明Trim26在膀胱癌组织和膀胱癌细胞中均表达上调，敲减Trim26表达后，抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭和转移 [18]；TRIM26在肺癌细胞系(H1299、A549)和肺癌患者肿瘤组织中明显高表达，TRIM26可能在肺癌中发挥癌基因的作用 [19]。可见Trim26的生物学功能非常复杂，其在不同肿瘤中可能发挥着完全不同的生物学功能，在同一肿瘤的不同细胞系中也可能发挥着相反的生物学功能。总之，目前我们对Trim26在肿瘤发生发展过程中的功能仍然不明确，还有待进一步深入研究。而我们前期的预实验结果显示Trim26在人HCC组织中表达显著下调，Trim26抑制小鼠的正常肝细胞增殖。我们课题组前期在人和小鼠主要组织器官中通过免疫组化研究Trim26表达谱的结果显示，Trim26在人和小鼠的正常肝脏中均有明显表达 [20]。Wang等的研究 [21] 发现Trim26在人HCC组织中表达水平明显下调，且该基因表达下调与HCC患者的不良预后密切相关。这些研究结果均提示Trim26表达下调可能与HCC的肿瘤发生相关。让Trim26在肝脏中表达缺失，可进一步研究该基因与HCC发生的相关性。目前，我们已制备了Trim26条件性基因敲除小鼠，对于进一步研究Trim26基因在肝癌发生中的作用及机制具有重要意义。

基金项目

云南省科技厅地方高校联合专项基金(202001BA070001-063、202001BA070001-043)；云南省科技厅基础研究专项基金(202001BA070001-043)；国家自然科学基金(82060425、81702778)；广西自然科学基金项目(2020GXNSFAA159131)。

NOTES

^*第一作者：夏加伟，韩留鑫。

^#通讯作者：赵文淘。