非小细胞肺癌组织中RBM3的表达及其与患者预后的相关性研究

Expression of RBM3 in Non-Small Cell Lung Cancer and Its Correlation with Prognosis of Patients

摘要: 目的：探讨RBM3 (RNA结合基序蛋白3，RNA binding motif protein 3)在非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)组织中的表达情况及其与患者临床病理学参数和预后的关系。方法：收集2014年8月1日至2015年8月1日在青岛市市立医院东院区胸外科行肺癌根治术的135例NSCLC患者，通过免疫组化染色方法检测RBM3的表达情况，通过卡方检验分析其与患者临床病理学参数的相关性，采用Kaplan-Meier法、log-rank检验法和Cox比例风险模型统计RBM3表达与患者OS (总生存期)及PFS (无进展生存期)的关系。结果：RBM3的表达与肿瘤组织分化程度(P = 0.015)、N分期(P = 0.005)、T分期(P = 0.032)、LVD (淋巴管密度，以D2-40进行标记) (P = 0.039)及MVD (微血管密度，以CD34进行标记) (P = 0.035)明显相关，差异具有统计学意义(P < 0.05)；单因素Cox回归分析表明：RBM3的表达、肿瘤组织分化程度、LVD、MVD、T分期、N分期是影响非小细胞肺癌的OS的因素(P < 0.05)；RBM3的表达、肿瘤组织分化程度、LVD、MVD、N分期是影响非小细胞肺癌的PFS的因素(P < 0.05)；Cox比例风险模型多因素分析表明，RBM3、N分期、T分期及LVD、MVD是影响NSCLC患者OS及PFS的独立危险因素(P < 0.05)。生存分析提示低表达RBM3患者的OS、PFS明显长于高表达RBM3的患者。结论：RBM3、N分期、T分期、LVD、MVD是非小细胞肺癌独立的预后因素。RBM3可能成为非小细胞肺癌总体生存率的预后标志物，并可能成为非小细胞肺癌治疗的潜在靶点，具有广阔的治疗前景。

Abstract: Objective: To investigate the expression of RBM3 (RNA binding motif protein 3) in non-small cell lung cancer (NSCLC) tissues and its relationship with clinical pathological parameters and prognosis of patients. Methods: A total of 135 patients with NSCLC who underwent radical resection of lung cancer in Department of Chest Surgery, Qingdao Municipal Hospital East Campus from August 1, 2014 to August 1, 2015 were collected. The expression of RBM3 was detected by immunohisto-chemistry, and its correlation with clinical pathological parameters was analyzed by Chi square test. The Kaplan-Meier method, log-rank test and Cox proportional risk model were used to calculate the relationship between RBM3 expression and OS (overall survival) and PFS (progression-free survival) of the patients. Results: The expression of RBM3 was significantly correlated with the degree of dif-ferentiation (P = 0.015), N-stage (P = 0.005), T-stage (P = 0.032), LVD (lymphatic vessel density, la-beled with D2-40) (P = 0.039) and MVD (microvessel density, labeled with CD34) (P = 0.035) (both P < 0.05). Univariate Cox regression analysis showed that the expression of RBM3, tumor tissue dif-ferentiation, LVD, MVD, T-stage, and N-stage were the factors affecting OS in NSCLC (P < 0.05). The expression of RBM3, the differentiation degree of tumor tissue, LVD, MVD, and N-stage were the fac-tors that affected the PFS of NSCLC (P < 0.05). Multivariate analysis using Cox proportional hazards model showed that RBM3, N-stage, T-stage, LVD and MVD were the independent risk factors for OS and PFS in patients with NSCLC (P < 0.05). Survival analysis indicated that the OS and PFS of pa-tients with low expression of RBM3 were significantly longer than those of patients with high ex-pression of RBM3. Conclusion: RBM3, N-stage, T-stage, LVD and MVD are independent prognostic factors for NSCLC. RBM3 may become a prognostic marker of overall survival for non-small cell lung cancer and a potential target for the treatment of non-small cell lung cancer, with a broad thera-peutic prospect.

1. 引言

肺癌作为全球负担最重的恶性肿瘤之一 [1] ，严重危害人类的身体健康，其中非小细胞肺癌约占85%。在全球所有癌症中，肺癌发病人数和死亡人数都位居第一。从GLOBOCAN 2020最新公布的数据可知，2020年全球新发肺癌病例约220万，占全部恶性肿瘤的11.4%，死亡病例约180万，占恶性肿瘤相关死亡的18.0%。中国肺癌发病数和死亡数分别占全球的37.0%和39.8% [2] 。

肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一。基于全球61个国家的预后数据显示，肺癌年龄标化的5年生存率仅有10.0%~20.0% [3] 。肺癌主要治疗手段包括手术、放化疗、免疫治疗和靶向治疗等。但非小细胞肺癌的5年存活率随着诊断分期的升高而降低 [4] ，尽管大量研究集中于肺癌的肿瘤抑制因子和癌基因，并试图揭示肿瘤发生、发展和转移的机制，但准确的潜在分子机制仍有待充分研究。对肺癌的潜在分子机制进行深入研究有助于开发新的临床诊断和治疗方法。因此进一步研究肺癌的发生、发展及作用机制，仍然是目前研究的重点。

RNA结合基序蛋白3 (RNA Binding Motif Protein 3, RBM3)是Danno等 [5] 于1995年首次在人类胎儿的脑组织cDNA文库中发现的。RBM3是哺乳动物体内重要的冷应激蛋白，也是高度保守RNA结合蛋白家族成员，在轻度低温的环境下它的表达量增加。此外，已证明RBM3可促进细胞增殖和红细胞生成分化 [6] [7] 。最近的研究表明，RBM3在人类结直肠癌 [8] [9] 和前列腺癌 [6] 中起促进作用。RBM3在人类卵巢癌 [10] 、尿路上皮膀胱癌 [11] 、恶性黑色素瘤 [12] ，以及胃腺癌 [13] 中高度表达。这些数据表明，RBM3能够在各种人类癌症中发挥不同作用并表现出组织特异性。据我们所知，迄今为止，RBM3在人类肺癌中的作用尚不清楚。

本实验采用免疫组化SP法检测NSCLC组织中RBM3表达，探讨其与临床病理特征及预后的关系，以期为NSCLC诊断和预后生物学标志物提供参考。

2. 资料和方法

2.1. 临床资料

从病案室的病例信息查询系统以及住院病人信息查询系统中，本研究收集了2014年8月1日至2015年8月1日于青岛市市立医院东院区胸外科行肺癌根治术的135例NSCLC患者的相关临床以及随访资料，包括性别、年龄、吸烟史，术后病理检查报告、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移等各项资料，以及患者每月到医院随访的资料、影像学检查结果以及血液化验等相关情况。此次研究全部病患的相关信息都有详尽的记录，其中包括手术治疗后的随访检查、病患疾病的进展状况、实验室的检查结果以及病患的死亡日期以及详细的死因。所选患者手术前均未实施过任何放化疗、靶向免疫以及中药等抗肿瘤疗法，均已通过术后石蜡病理检查确诊为非小细胞肺癌，且术后标本保存完好。其中男性61例，女性为74例。年龄42至75岁。根据美国抗癌联合会(AJCC, American Joint Committee on Cancer)第8版TNM分期标准进行分期，T1 54例，T2 38例，T3 43例。淋巴结阳性80例，淋巴结阴性55例。高、中分化59例，低分化76例。本实验经青岛市市立医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

2.2. 方法

对组织上的RBM3表达，经免疫组化技术定位、定性检测，主要免疫组化技术实验步骤：取NSCLC组织石蜡标本，4 μm厚连续切片，经二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化。EDTA修复液高温修复抗原，3% H₂O₂孵育10 min，加入10%山羊血清封闭10 min。加入1:100稀释的兔抗人RBM3单克隆抗体4℃过夜孵育，次日加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体，在室温下孵育30分钟。(注：辣根过氧化物酶对光敏感，应避免不必要的光暴露)。PBS冲洗后，将DAB显色剂均匀滴加到玻片上，染色3~15分钟，后继续PBS缓冲液冲洗，苏木精复染、脱水、透明，封片，镜下观察(见表1和表2)。

Table 1. Details of experimental reagents used

表1. 所用实验试剂详情

Table 2. Details of the instruments used in the experiment

表2. 实验所用仪器详情

2.3. 结果判读

由两位职称均为副主任医师以上的病理科医师独立阅片，当两位医师计数后分组结果不一致时，由第三位病理科主任医师重新计数并分组。每张切片随机选取5个高倍镜视野(400×)计数细胞。RBM3蛋白表达以细胞核呈棕黄或棕褐色颗粒为阳性。按细胞染色强度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，黄色或深黄色为2分，棕黄或棕褐色为3分。按阳性细胞数所占比例评分：阳性细胞数 < 10%为0分，10%~24%为1分，25%~49%为2分，50%~74%为3分，≥75%为4分。两者相乘即为总评分，0~1为阴性，2~4为弱阳性，5~8为中度阳性，9~12为强阳性。为了确定RBM3表达是否与临床病理特征相关，将RBM3表达水平为阴性与弱阳性定义为RBM3低表达组，表达水平是中阳性及强阳性定义为RBM3高表达组。

2.4. 对照

此次研究还设置了阴性对照组，通过此方式使得实验的客观性得以保障，对实验的染色结果，有效地排除了此次研究因素之外产生的干扰以及影响，同时也让显色分数的收集以及计数变得更为明了。在免疫组化染色中，阴性对照组会用PBS缓冲液替代实验组中用到的一抗，同时还会向其中加入等量的液滴。除此步骤，其余实验相关步骤与阳性实验组中的一致。

2.5. 统计学方法

统计学分析应用SPSS 23.0软件进行。RBM3表达与各临床病理参数之间的组间数据分析比较采用卡方检验；采用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线；采用Cox比例风险模型来确定各变量对OS、PFS的影响，P < 0.05为差异具有统计学意义。log-rank检验法分析RBM3表达与患者OS、PFS之间的关系，P < 0.05为差异具有统计学意义。

2.6. 随访

此次研究，对135位病患进行了仔细且完整的随访记录。2020年8月1日是随访结束的日期。随访期间内，一共对117位患者进行了随访，另外18位病患与其家属均因不同原因失访，无法准时完成相应的随访。假若医护人员在连续3天的随访中，无法联系到患者以及其家属，则次病例就会被定义为失访。因此，此次研究的随访完成率是86.7%。在全部完成了随访的患者中，有7名患者退出了研究，15名患者因研究时限已到而停止观察。所以最终可以分析的数据仅有95例病人的病例随访结果。随访的方式主要是通过电话随访和翻阅该病患在本院住院期间的一系列有关资料。

3. 结果

3.1. NSCLC组织中RBM3的表达情况

NSCLC组织中RBM3的表达情况见图1~6。

Figure 1. RBM3 enrichment group ×10

图1. RBM3富集组×10

Figure 2. RBM3 sparse group ×10

图2. RBM3稀疏组×10

Figure 3. RBM3 enrichment group ×20

图3. RBM3富集组×20

Figure 4. RBM3 sparse group ×20

图4. RBM3稀疏组×20

Figure 5. RBM3 enrichment group ×40

图5. RBM3富集组×40

Figure 6. RBM3 sparse group ×40

图6. RBM3稀疏组×40

3.2. RBM3与临床病理参数的关系

RBM3的表达与肿瘤组织分化程度(P = 0.015)、N分期(P = 0.005)、LVD (P = 0.039)、MVD (P = 0.035)及T分期(P = 0.032)明显相关，差异具有统计学意义(P < 0.05) (见表3)。

Table 3. Relationship between RBM3 and clinicopathological parameters

表3. RBM3与临床病理参数的关系

3.3. RBM3与OS、PFS的单因素分析

单因素Cox回归分析表明：RBM3的表达、肿瘤组织分化程度、LVD、MVD、T分期、N分期是影响非小细胞肺癌OS的因素(P < 0.05)；RBM3的表达、肿瘤组织分化程度、LVD、MVD、N分期是影响非小细胞肺癌PFS的因素(P < 0.05) (见表4)。

Table 4. Univariate analysis of RBM3 and OS and PFS

表4. RBM3与OS、PFS的单因素分析

3.4. RBM3与OS、PFS的多因素分析

Cox比例风险模型的多因素分析表明，RBM3的表达、N分期、T分期、LVD、MVD均是影响OS、PFS的独立危险因素(P < 0.05) (见表5)。

Table 5. Multifactorial analysis of RBM3 and OS and PFS

表5. RBM3与OS、PFS的多因素分析

3.5. 生存分析

生存分析显示：RBM3高表达患者OS、PFS较低表达患者OS、PFS之间具有显著差异性，说明RBM3高表达者较低表达者在生存预后方面危险度更高，RBM3的表达是影响非小细胞肺癌预后的因素之一(见图7~16)。

Figure 7. Comparison of OS between patients with high and low expression of RBM3

图7. RBM3高表达与低表达患者OS比较

Figure 8. Comparison of PFS between patients with high and low RBM3 expression

图8. RBM3高表达与低表达患者PFS比较

Figure 9. Comparison of OS in patients with and without lymph node metastasis

图9. 淋巴结有无转移患者OS比较

Figure 10. Comparison of PFS in patients with and without lymph node metastasis

图10. 淋巴结有无转移患者PFS比较

Figure 11. Comparison of OS between patients with different T-stages

图11. T分期不同患者OS比较

Figure 12. Comparison of PFS in patients with different T-stages

图12. T分期不同患者PFS比较

Figure 13. Comparison of OS in patients with different LVD expression

图13. LVD表达不同患者OS比较

Figure 14. Comparison of PFS in patients with different LVD expression

图14. LVD表达不同患者PFS比较

Figure 15. Comparison of OS in patients with different MVD expression

图15. MVD表达不同患者OS比较

Figure 16. Comparison of PFS in patients with different MVD expression

图16. MVD表达不同患者PFS比较

4. 讨论

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，居全球癌症死亡的第一位 [1] 。其中非小细胞肺癌约占85%。NSCLC治疗中，早期可以通过手术切除，但大部分患者约70%最初诊断时即表现为晚期或转移 [14] 。晚期NSCLC的预后极差，中位生存时间约为1年，5年生存率不足20% [15] 。目前已经证实肺癌的致癌因子有吸烟、空气污染、环境因素、电离辐射、ras、myc基因家族等 [16] ，但RBM3与肺癌的发生、发展、作用机制研究较少。本文旨在研究RBM3在非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)病理组织中的表达情况与病人总生存期(Overall Survival, OS)、无进展生存期(Progress-Free Survival, PFS)的关系。由此进一步了解或明确肿瘤发生发展的可能机制，以期发现更有效的诊疗方式来提高肺癌的治疗效果。

RBM3最初在胎儿大脑cDNA文库中被发现，并由Derry等人于1995年首次分离出来 [5] 。RBM3是一种高度保守的冷诱导RNA结合蛋白，是三种X-染色体相关联的RBM基因(RBMX, RBM3, RBM10)之一，定位于Xp11.23，在应激反应中转录上调 [5] ，参与mRNA的生物作用，刺激蛋白质合成，促进细胞增殖，发挥抗凋亡作用。目前，越来越多的研究表明RBM3能够作为原癌基因发挥作用，与各种癌症的进展和转移相关 [17] 。临床认为RBM3为潜在原癌基因，分析原因：RBM3表达水平与肿瘤分期相关，这表明RBM3水平影响着肿瘤发生；RBM3沉默会增加G2/M期细胞数量，导致细胞最终凋亡；RBM3可提高血管内皮生长因子mRNA、IL-8、环氧化酶的稳定、翻译 [18] [19] ；其中mRNA翻译水平变化在肿瘤发生、细胞转化中发挥着重要作用，RBM3可与mRNA直接结合，而改变mRNA二级结构，影响核糖体亚基与起始因子的访问，并调节激酶潜在活性。RBM3在大多数人类肿瘤中高表达 [9] [20] ，并且最早基于基因抗体的方法阐明了RBM3作为肿瘤标记物的作用。RBM3在肿瘤发生和临床结果预测中的参与已被广泛研究，在许多癌症中有不同的结论，包括乳腺癌，尿路上皮癌，前列腺癌，结肠直肠癌和胃癌 [11] [21] [22] [23] [24] 。然而，RBM3在NSCLC中的作用尚未见报道。随着对RBM3研究的不断深入，RBM3蛋白在肿瘤中的发生、发展中的作用被越来越多人重视。以往认知，RBM3是通过冷休克刺激产生的，其作用于增殖中的作用应起到抑制而非促进的作用，但是，近期发现在多种肿瘤细胞中RBM3在成瘤或促进增殖方面达上调。例如，RBM3在纯化的CD34+细胞中表达上调，提示其在造血系统中起到增殖的作用，这与我们的实验结果相吻合，即RBM3与MVD相关。关于RBM3的一个假想说法认为，它可能通过影响DDR (DNA的损伤修复)和其稳定性来促进肿瘤早期发生进展，从而降低了阈值造成了更多的恶性克隆 [10] [19] 。一旦具有侵袭能力的肿瘤发生，高水平的RBM3的表达可能会影响染色体的稳定性和对化疗的敏感性 [19] 。

有研究显示RBM3的表达与肿瘤病理分期相关，但其与侵袭及增殖相关的机制尚未明确。相关人员通过免疫组化及组织微阵列芯片检测88例良性及恶性前列腺肿瘤中RBM3的表达水平，发现在手术切除的良性膀胱肿瘤的组织中RBM3鲜有表达，而在膀胱恶性肿瘤中其表达量明显增高，并且在有远处侵袭性膀胱癌中表达更高。数据表明，RBM3在膀胱移行细胞癌中高表达，相对于原位侵袭性，其机制更倾向作用于远处转移 [25] 。我们推断RBM3可能在推动早期成瘤机制中，可能通过维持DNA的完整性来起作用。但是在不同类型癌症的发生发展过程中RBM3发挥的作用是完全不同的，或许是因为所处的病理条件不同。在卵巢癌 [10] 、前列腺癌 [21] 、星形细胞瘤 [26] 、鼻咽癌 [27] 等癌症中，RBM3被检测出高表达，并且RBM3表达还影响着癌症患者的各项临床病理参数。尽管在大多数类型的癌症中，RBM3表达都与患者预后水平密切相关 [28] ，却与食管癌患者预后没有太大关系 [29] 。本次研究中，RBM3在有淋巴结转移的NSCLC中呈现高表达，而在无淋巴结转移的NSCLC中，RBM3表达低，差异具有统计学意义(P < 0.05)，可说明RBM3在恶性肿瘤的远处转移中起一定作用并与患者预后不良相关。作者推测这些不同分析结果，可能是由于在单个器官中RBM3与其他被激活和表达的基因之间相互作用造成的。

在本次实验中有一些局限性。首先，尽管长期随访使我们的结果更有说服力，但还需要对大量患者进行额外的前瞻性研究来证实我们的结论。第二，免疫组化检测出的RBM3分子只是原始肿瘤组织的样本，并不能反映出它在肿瘤微环境相互作用的完整信息。我们的研究清楚地证明了RBM3在预测NSCLC患者生存率中的预后价值。不同研究中差异的原因尚不清楚，将来可能仍需要更大的队列来确定RBM3在疾病过程中的积极或消极作用。

综上所述，高表达的RBM3 (Immunohistochemical Staining，免疫组织化学染色)可作为独立的预后标志物，RBM3的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、LVD、MVD及T分期、N分期明显相关，RBM3可能成为重要的临床预后标志物治疗非小细胞肺癌。总之，RBM3蛋白高表达与NSCLC发生、发展及转移过程中的不良事件如肿瘤浸润、淋巴结转移等呈负相关，且与NSCLC预后不良有关。分析RBM3在NSCLC中的临床病理学意义和预后价值，有助于理解NSCLC发生、发展过程，有望为NSCLC诊断、靶向治疗和预后评估提供新靶点。

NOTES

^*通讯作者。