基于网络药理学探讨蛇床子治疗排卵障碍型不孕症的作用机制

To Explore the Mechanism of Cnidium Ossiformis in Treating Ovulation Disorder Infertility Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：基于网络药理学研究蛇床子治疗排卵障碍型不孕症的作用机制。方法：从TCMSP、OMIM、Drugbank、GeneCards、PharmGkb数据库中确定蛇床子的潜在活性成分、作用靶点和疾病的差异基因，取两者交集，利用Cytoscape 3.9.0软件构建“中药–活性成分–交集靶点–疾病”调控网络图，string数据构建蛇床子和排卵障碍型不孕症的PPI网络；通过R包进行GO和KEGG功能富集分析。结果：经TCMSP数据库确定蛇床子有18个化合成分，59个药物靶标；经OMIM、Drugbank、GeneCards、PharmGkb数据库分析确定蛇床子治疗排卵障碍型不孕症靶点21个，利用string数据构建蛇床子和排卵障碍型不孕症的靶点。GO分析表明生物过程(BP)涉及类固醇激素反应、生殖腺发育、排卵周期等，细胞成分(CC)涉及孔隙复合体、薄膜筏、膜微区等区域，分子功能(MF)涉及半胱氨酸型内肽酶活性与凋亡过程、肾上腺素能受体活性、类固醇结合等生物学过程。KEGG结果表明，蛇床子治疗排卵障碍型不孕症的传导途径主要包括雌激素信号通路、细胞凋亡、VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路等。结论：蛇床子改善排卵障碍型不孕症的作用机制可能是蛇床子中的beta-sitosterol、Stigmasterol、o-Isovaleryl columbianetin、O-Acetylcolumbianetin、Xanthoxylin N等有效成分通过影响AR、CASP3、PGR、PTGS2、ESR1等基因的表达进而调控了雌激素信号通路、细胞凋亡、VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路等信号传导途径实现的。

Abstract: Objective: To study the mechanism of ovulatory dysfunction infertility treated by Cnidium ossi-formis based on network pharmacology. Methods: From TCMSP, OMIM, Drugbank, GeneCards and PharmGkb databases, the potential active components, target sites and differential genes of the disease were determined, and the intersection of the two was selected. Cytoscape 3.9.0 software was used to construct the regulatory network diagram of “Traditional Chinese Medicine, active ingredient, intersection target-disease”, and PPI network of ovulatory dysfunction infertility was constructed with string data. Functional enrichment analysis of GO and KEGG was performed using R packets. Results: Eighteen compound components and 59 drug targets were determined by TCMSP database. Through the analysis of OMIM, Drugbank, GeneCards and PharmGkb databases, 21 targets for the treatment of ovulational dysfunction infertility were determined, and the targets for the treatment of ovulational dysfunction infertility and ovulational dysfunction infertility were constructed using string data. GO analysis showed that biological process (BP) involved steroid hormone response, gonad development, ovulation cycle, cellular component (CC) involved pore complex, membrane raft, membrane microregion and other regions, molecular function (MF) involved cysteine-type endopeptidase activity and apoptosis process, adrenergic receptor activity, steroid binding and other biological processes. KEGG results showed that the main pathways of cnidium os-sium in the treatment of ovulation disorder infertility include estrogen signaling pathway, apoptosis, VEGF signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, IL-17 signaling pathway, etc. Conclusion: The mechanismof ambrosia cotyloides ameliorating ovulation disorder infertility may be beta-sitosterol, Stigmasterol, o-Isovaleryl columbianetin, O-Acetylcolumbianetin, Xanthoxylin in Ambrosia cotyloides By affecting the expression of AR, CASP3, PGR, PTGS2, ESR1 and other genes, the active components such as N regulate the estrogen signaling pathway, cell apoptosis, VEGF signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, IL-17 signaling pathway and other signal transduction pathways.

1. 引言

不孕症是妇科常见的难治性疾病，近年来不孕症患病率逐渐上升，已经成为影响女性生殖健康的重要疾病，其中排卵障碍型不孕症约占女性不孕症的20%~30% [1] 。排卵障碍型不孕症是卵巢由于某些原因影响出现排卵功能障碍而未能排卵及影响精子与卵子结合所导致的不孕，其病因复杂，是临床诊疗的重难点。

蛇床子是传统医学中常用的攻毒、杀虫、止痒类药物，其温肾助阳的功效常被忽略，《本草崇原》记载：“蛇床子，不独助男子，且有益妇人，乃世人舍此而求补药于远域，且近时但用为疮药，惜哉。”国医大师何成瑶教授将蛇床子作为治疗排卵障碍型不孕的核心用药之一，取得了良好的临床疗效，但其具体作用机制尚不清楚 [2] 。我们使用网络药理学研究蛇床子与排卵障碍型不孕症之间的相互作用。网络药理学是一种以系统药理学为基础，研究药物与疾病相互作用的新兴学科 [3] 。在网络药理学中，药物–靶点网络使研究人员探究药物治疗疾病的作用机制更加简洁。疾病靶点可应用于药物设计、药物发现和生物标志物检测领域 [4] 。基于此，本研究运用网络药理学手段，尝试构建“成分–靶点–通路–疾病”多维网络，从而探索蛇床子治疗排卵障碍型不孕症的潜在分子机制，为蛇床子的临床应用以及排卵障碍型不孕症相关疾病基础与临床研究提供一定的理论依据。

2. 方法

2.1. 蛇床子药物活性成分及靶点的收集

采用TCMSP数据库及查阅相关文献筛选蛇床子的有效成分及药物靶点。有效成分筛选标准为：口服生物利用度(Oral bioavailability, OB) ≥ 30%，类药性(Drug likeness, DL) ≥ 0.18。

2.2. 蛇床子靶点的获取

基于TCMSP 2.3，将蛇床子的多个活性成分与潜在作用靶点逐个配对，筛选结束后，把蛇床子活性成分作用的蛋白质通过UniProt蛋白数据库(https://www.uniprot.org)进行标准化，继而得到靶点蛋白的官方名称，以此可以预测蛇床子活性的作用靶点。

2.3. 排卵障碍型不孕症靶点的获取

用“Anovulatory infertility”作为关键词，在人类孟德尔遗传数据库Drugbank、GeneCards、OMIM、PharmGkb数据库中检索，得到排卵障碍型不孕症的相关靶点。与上述蛇床子的活性成分预测作用靶点取交集，得到蛇床子治疗排卵障碍型不孕症的作用靶点。

2.4. “中药–有效成分–靶点–疾病”网络的构建

使用Cytoscape 3.9.0软件构建“中药–活性成分–交集靶点–疾病”调控网络图，并进行拓扑分析，通过Cytoscape 3.9.0软件中计算连接度(Degree)参数来评判药效成分与靶点的重要性。

2.5. 蛋白互作网络的构建与分析

将蛇床子治疗排卵障碍型不孕症的潜在作用靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/)，物种设定为“Homo sapiens”，获得蛋白与蛋白之间的相互作用关系，将数据保存为TSV格式，获得PPI网络信息，将信息导入Cytoscape 3.9.0，绘制PPI网络并进行拓扑分析。

2.6. 富集分析

为了研究与潜在目标相关的生物学功能，我们通过“clusterProfiler”R包进行了基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。“clusterProfiler”R包作为一种富集工具，具有基于多种资源的集成基因聚类分析。GO富集分析从三个维度对基因进行解释和注释，包括细胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)分析。KEGG数据库主要用于通路分析。P ≤ 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 中药化合成分及靶点的获取

蛇床子有18个化合成分，59个药物靶标。其中，beta-sitosterol、Stigmasterol、o-Isovaleryl columbianetin、O-Acetylcolumbianetin、Xanthoxylin N等物质是蛇床子中含有排卵障碍型不孕症靶点较多的成分。

3.2. 疾病靶点的获取

1618个疾病靶点与59个药物靶标取交集后，共获得21个差异基因(见图1)。

Figure 1. Venn of drug target and disease target

图1. 药物靶点与疾病靶点的韦恩图

Figure 2. Traditional Chinese medicine—active ingredients—target—disease network diagram

图2. 中药–有效成分–靶点–疾病网络图

3.3. “中药–有效成分–靶点–疾病”网络的构建及主要有效成分筛选

使用Cytoscape 3.9.0绘制蛇床子有效成分治疗排卵障碍型不孕症的基因网络图(图2)。基于蛇床子活性成分与排卵障碍型不孕症疾病靶点的相互作用，采用Cytoscape软件构建“药物–活性成分–交集靶点–疾病”网络，结果见图2。图中39个节点分别代表药物、疾病、交集靶点、活性成分等，79个线代表两节点之间的互作关系。结果显示，其中度值前五的药物分别是beta-sitosterol、Stigmasterol、o-Isovaleryl columbianetin、O-Acetylcolumbianetin、Xanthoxylin N。度值前五的靶点是PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NCOA2、ADRB2。

3.4. 蛋白互作网络的构建与分析

结果见图3。AR、CASP3、MET、PGR、HSP90AA1、PTGS2、ESR1、NCOA2、NCOA1、BAX、CASP9、BCL2、KDR、NOS2、PLAU、OPRM1、PTGS1可能是在蛇床子治疗排卵障碍型不孕症中发挥重要作用的核心靶点。

3.5. 富集分析

基因本体(GO)分析结果显示(图4)，生物过程(BP)涉及类固醇激素反应、生殖腺发育、排卵周期、生殖结构发育、生殖系统发育、节律过程、细胞对药物的反应、细胞对类固醇激素刺激的反应、细胞内类固醇激素受体信号通路。细胞成分(CC)涉及孔隙复合体、薄膜筏、膜微区、膜区、髓磷脂鞘、核染色质、枝晶末端、神经元细胞体、内吞囊腔、转录活性染色质、高密度脂蛋白颗粒、蛋白质–脂质复合物。分子功能(MF)涉及半胱氨酸型内肽酶活性与凋亡过程、肾上腺素能受体活性、类固醇结合、RNA聚合酶II通用转录起始因子结合、儿茶酚胺结合、核受体结合、四吡咯结合、雌激素受体结合、一般转录起始因子结合、激素受体结合。

Figure 3. Construction and analysis of PPI protein interaction network

图3. PPI蛋白互作网络的构建与分析

Figure 4. GO analysis bar chart

图4. GO分析条形图

Figure 5. KEGG analysis bubble chart

图5. KEGG分析气泡图

基因组百科全书(KEGG)分析结果表明(图5)，蛇床子治疗排卵障碍型不孕症的信号通路包括雌激素信号通路、细胞凋亡、p53信号通路、甲状腺激素信号通路、VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、内分泌抵抗、NF-κB信号通路、钙信号通路、血清素能突触、内质网中的蛋白质加工、花生四烯酸代谢、孕激素介导的卵母细胞成熟、HIF-1信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、鞘磷脂信号通路、神经营养素信号通路、卵母细胞减数分裂、精氨酸生物合成。

4. 讨论

排卵障碍是女性不孕症的重要原因之一，约占女性不孕症的20%~30%。现代医学认为排卵障碍的发生主要涉及下丘脑–垂体–卵巢轴病变及其他一些内分泌病变 [5] 。来曲唑、枸橼酸克罗米芬等促排药物是西医促排卵治疗的一线用药 [6] 。大量研究表明，相对于单纯的西医治疗，结合中医药疗法治疗排卵障碍或有更优的疗效 [7] 。有学者应用温肾促卵方治疗排卵障碍型不孕症，药物组成包含覆盆子、菟丝子、续断、熟地黄、党参、桃仁、红花等，结果显示，观察组患者的受孕率明显高于单纯使用枸橼酸氯米芬胶囊治疗的对照组患者 [8] 。夏桂成教授以调周法为基础，自拟补天种玉丹加减治疗排卵障碍，临床观察表明患者的排卵和自然受孕情况得到极大改善 [9] 。傅汝梅教授认为脾肾亏虚、冲任损伤是排卵障碍型不孕症的主要病机，提出“养泡助卵”的思想，自拟山紫三子助孕汤加减以补肾健脾、调动冲任气血，从而提高排卵率，临床疗效显著 [10] 。杜惠兰教授以“肝肾并重，长排同调”为原则，运用补肾调经II号方、补肾调经III号方加减调补肝肾，明显提高排卵障碍性不孕症患者的排卵率及妊娠率 [11] 。国医大师何成瑶教授在“阴阳交感、冲气为和”的中医生殖观理论指导下，提出“养精不唯填精，亦在温枢三焦”、“育胞不求形变，而求气化交感”的观点，丰富了不孕症的中医治疗思路 [12] 。笔者在跟师学习时发现何成瑶教授时常用蛇床子治疗排卵障碍型不孕症。《名医别录》记载：“蛇床子能温中下气，令妇人子脏热，男子阴强。久服轻身，令人有子。”《本草蒙筌》记载：本品“妇人无娠，最宜久服。”现代药理研究表明，蛇床子具有促性腺激素样作用与雌激素样作用，其雌激素样作用可能与其增加子宫雌激素受体的表达及提高血清雌二醇水平有关 [13] [14] 。

本研究表明，beta-sitosterol、Stigmasterol、o-Isovaleryl columbianetin、O-Acetylcolumbianetin、Xanthoxylin N等物质是蛇床子中含有排卵障碍型不孕症靶点较多的成分。其中，β-谷甾醇(beta-sitosterol)是一种植物甾醇类雌激素，研究表明，β-谷甾醇(beta-sitosterol)具有雌激素活性，可作用于卵巢颗粒细胞促进其产生E2，E2能够维持卵泡的生长发育 [15] 。豆甾醇(Stigmasterol)是一种有机化合物，属于植物甾醇，是医药上制造孕酮的原料 [16] ，孕酮是维持妊娠所必需的孕激素，能通过降低子宫肌的兴奋性、维持蜕膜反应、抑制受精卵着床后的免疫排斥反应等起到保胎的作用。o-异戊酰基哥伦比亚甙元(O-Isovaleryl columbianetin)、o-乙酰基哥伦比亚甙元(O-Acetylcolumbianetin)均是蛇床子素中的主要成分，相关研究表明蛇床子素能够一定程度升高血清雌二醇含量，改善内分泌紊乱，促进卵泡生长发育及排卵 [17] 。此外，蛇床子素可能通过调控Nrf2/HO-1/NLRP3信号通路蛋白水平减轻卵巢的氧化应激损伤和炎性反应，从而改善内分泌紊乱，促进卵泡正常生长发育，恢复卵巢功能 [18] 。

PPI结果显示，AR、CASP3、PGR、PTGS2、ESR1等关键靶点参与了排卵障碍型不孕症的发展，且能被蛇床子所干预。AR是一种类固醇受体蛋白，Takeda [19] 等通过研究发现AR在哺乳动物体内各器官、组织的表达十分广泛，其中雌雄性生殖器官中表达量最高。Takayama等 [20] 发现AR在各级卵泡的卵泡膜细胞上均有表达，AR介导的雄激素作用对于正常卵泡发育至关重要 [21] 。动物实验表明，AR敲除小鼠的卵巢颗粒细胞线粒体形态明显异常，引起生成ATP减少以及异常的线粒体生物合成，进而影响窦前卵泡生长及卵泡闭锁过程，同时卵母细胞成熟率显著下降 [22] 。CASP3具有半胱氨酸蛋白酶活性，是细胞凋亡过程中激活的关键激酶，也是细胞凋亡的主要效应因子。激活的CASP3使底物PARP (poly-ADP-ribose polymerase)发生水解，其水解产物促进细胞骨架降解和DNA片段化 [23] [24] 。PGR是配体活化的转录因子，在排卵前卵巢的颗粒细胞中特异性表达。大量研究证明孕酮对于排卵的作用必不可少，而孕酮的生理作用通过PGR来介导，相关研究表明，PGR的表达显著影响排卵前卵泡的破裂和卵母细胞的释放 [25] 。PTGS2是生物体内前列腺素合成起始步骤的关键酶，已证实在多种病理生理过程中有着重要作用，例如影响肿瘤、癌症的形成，且与排卵、胚胎移植、蜕膜、分娩等多种繁殖性能有关 [26] [27] 。研究表明，PTGS2基因缺陷可导致卵巢发育过程中黄体的缺乏、卵母细胞的突变及第一极体的未能排出，从而导致多种动物繁殖失败。ESR1基因存在于6q25染色体上，其编码产物ER-α可与雌激素结合，起到刺激促性腺激素分泌、调节卵泡生成的生理作用 [28] 。因此，研究AR、CASP3、PGR、PTGS2、ESR1等靶点的表达和调控对排卵障碍型不孕症的发病机制和治疗具有重要意义。

KEGG结果表明，蛇床子对排卵障碍型不孕症患者雌激素信号通路、细胞凋亡、VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路等信号传导途径起到主要调控作用。大量研究证明，雌激素信号通路与卵母细胞的生长发育及排卵过程密切相关。雌激素通过两种信号通路介导其细胞作用，这两种信号通路被分为“核起始的雌激素信号通路”和“膜起始的雌激素信号通路” [29] 。在核起始的雌激素信号通路中，雌激素结合ERα或ERβ受体后转位至细胞核，与应答元件(estrogen response element, ERE)结合后激活下游信号通路 [30] 。在膜起始的雌激素信号通路中，雌激素也能与质膜上的ER亚群(mER)或G-蛋白偶联受体(GPR30)结合发挥作用，继而影响下游转录因子 [31] 。有研究表明，雌激素与ERβ受体结合能提高卵巢颗粒细胞增殖能力，同时降低颗粒细胞凋亡因子FoxO3的表达，减少颗粒细胞凋亡，对卵子的生长发育和排卵过程至关重要 [32] 。PI3K-Akt信号通路影响着始基卵泡的生长、发育过程，同时与颗粒细胞的增生、分化密不可分 [33] 。

参考文献