miR-298通过抑制TAZ改善耐药肺癌细胞株的耐药性

miR-298 Improving Drug Resistance of Drug-Resistant Lung Cancer Cell Lines by In-hibiting TAZ

摘要: 目的：寻找在肺癌耐药性生成中起到调节作用的miRNA，研究miR-298在肺癌耐药细胞株中的表达规律及作用，探讨miR-298通过靶向TAZ调节耐药肺癌细胞株的作用，为肺癌寻找新的治疗靶点。方法：利用生物信息学技术分析顺铂耐药与敏感的肺癌病人中差异表达的miRNA，通过建立顺铂耐药的肺癌细胞株模型，验证miR-298表达下调。利用miR-298 mimics转染，验证miR-298对耐药肺癌细胞株的作用，通过转染WB，RT-PCR、双荧光素酶报告实验验证miR-298对TAZ的靶向调控作用，通过转染TAZ-siRNA检测TAZ在肺癌耐药株中的作用。结果：我们通过生物信息学技术发现miR-298在顺铂耐药的肺癌病人标本中低表达，在顺铂耐药肺癌细胞呈低表达，通过miR-298 mimics转染可以增高miR-298的表达量，可以在一定程度上改善顺铂的耐药性，同时抑制细胞的克隆形成。TAZ在肺癌耐药细胞中表达增高，miR-298可以靶向下调TAZ的表达，而敲低顺铂耐药细胞株中的TAZ，可以改善顺铂耐药，抑制细胞克隆形成。结论：miR-298在肺癌耐药中发挥重要的调节作用，通过上调miR-298可以改善肺癌的耐药性，miR-298可能是通过靶向抑制TAZ发挥作用的。

Abstract: Objective: To find miRNAs that play a regulatory role in the generation of lung cancer drug re-sistance, to study the expression and role of miR-298 in lung cancer drug-resistant cell lines, and to explore the role of miR-298 in regulating drug-resistant lung cancer cell lines by targeting TAZ, To find new therapeutic targets for lung cancer. Methods: Using bioinformatics technology to analyze the differentially expressed miRNAs in cisplatin-resistant and sensitive lung cancer patients, and establish a cisplatin-resistant lung cancer cell line model to verify the down-regulation of miR-298. Transfection with miR-298 mimics was used to verify the effect of miR-298 on drug-resistant lung cancer cell lines. The targeted regulation of miR-298 on TAZ was verified by transfection of WB, RT-PCR, and dual luciferase report experiments. TAZ-siRNA was used to detect the role of TAZ in drug-resistant lung cancer strains. Results: Through bioinformatics technology, we found that miR-298 is low in cisplatin-resistant lung cancer patient specimens and low in cisplatin-resistant lung cancer cells. Transfection with miR-298 mimics can increase the expression of miR-298 the amount can improve the drug resistance of cisplatin to a certain extent, while inhibiting the for-mation of cell clones. TAZ expression is increased in lung cancer drug-resistant cells, miR-298 can target down-regulation of TAZ expression, and knocking down TAZ in cisplatin-resistant cell lines can improve cisplatin resistance and inhibit cell clone formation. Conclusion: miR-298 plays an im-portant regulatory role in lung cancer drug resistance. Up-regulating miR-298 can improve lung cancer drug resistance, and miR-298 may play a role through targeted inhibition of TAZ.

1. 简介

肺癌是全世界范围内造成死亡最多的癌症，据报道在2018年，约有200余万人被诊断为肺癌，约有160余万人死于肺癌 [1] 。在所有类型的肺癌中，非小细胞性肺癌(NSCLC)最为常见，约有85%为NSCLC，NSCLC包括肺腺癌和肺鳞癌。NSCLC的预后差，死亡率很高。尽管近年来诊断和治疗的技术飞速发展，但NSCLC的复发和死亡率仍然很高，NSCLC的预后并没有得到明显的改善，在全球范围内的5年生存率 < 15% [2] 。铂类的化疗药物包括顺铂，它被用于手术后的化疗以及无法手术的患者，但这类药物经常会获得耐药性，NSCLC耐药性生成后，顺铂治疗的有效性明显减弱。因此探究引起顺铂耐药性的分子机制对发展NSCLC的新治疗手段具有非常重要的意义。

MicroRNAs (MiRNA)是一种长度为20~22个核苷酸的短链非编码RNA，通过影响mRNA的稳定性以及结合转录位点，miRNA能够调节转录后的基因表达。miRNA可以调控人体内30%左右的蛋白编码基因，广泛地参与包括增殖、分化、代谢等各种生理活动，并且miRNA表达的失调与肿瘤的发生发展密切相关。近年来，有许多学者报道miRNA与肿瘤的耐药性有很大的关联。比如miR-765在耐药的胃癌细胞以及病人血清中表达上调，通过靶向结合BATF2调节促进肿瘤耐药 [3] 。miR-29a可以通过促进PTEN在结肠癌细胞中的表达，逆转P糖蛋白诱导的耐药性 [4] 。miR-298在许多类型的肿瘤中表达异常，比如甲状腺癌 [5] 、肝癌 [6] 、结肠癌 [7] 等，有研究报道miR-298对肺癌的发生发展和转移的过程起到调节作用 [8] ，并且有少量报道miR-298与肿瘤的耐药机制有一定的关联 [9] 。但miR-298是否在肺癌的耐药性生成中起到重要的作用，目前尚未有研究报道。

在本次研究中，我们通过生物信息学技术发现miR-298在顺铂耐药的NSCLC中表达下降，利用建立的顺铂耐药的NSCLC细胞株，我们验证了miR-298在顺铂耐药株中表达下降，上调miR-298可以改善顺铂耐药株的耐药性，并降低其克隆形成能力，我们进一步研究发现miR298可以靶向抑制具有PDZ结合基序的转录共激活子(Transcriptional Coactivator with PDZ-binding motif, TAZ)，miR-298改善顺铂耐药的效应可能是通过抑制TAZ产生的。

2. 实验方法

2.1. 生物信息学分析

利用GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，检索肺癌耐药相关的芯片数据，搜索获得基因芯片GSE168707。下载芯片数据及平台注释文件，利用perl语言进行注释，R语言limma包对数据进行差异性分析，以log2 fold change = 1，p value < 0.05为标准。

2.2. 细胞培养与转染

人非小细胞肺癌细胞A549购买自普诺赛生物(武汉)，细胞培养于5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中，用含10% FBS及1%青链酶素的DMEM高糖培养基培养。miR-298 mimics，NC mimics，TAZ siRNA，NC siRNA使用Lipofectamine 2000作为载体进行转染，转染步骤依据试剂盒说明书。

2.3. 耐药细胞株建立

取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549，利用含顺铂的DMEM高糖培养基培养，不断提高顺铂的药物浓度，依次使用2､4､8､16､32､64 μmol/mL顺铂的培养基培养，在每个药物浓度下持续培养30天，最后得到耐药的细胞株，利用CCK-8检测顺铂对耐药细胞抑制率。成功构建耐药细胞株后，利用浓度为64 μmol/mL含顺铂培养基维持耐药细胞株的耐药性。

2.4. CCK-8实验

收集对数生长期的各组细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，将96孔板置于37度，5%二氧化碳的培养箱中培养24小时后，经不同处理因素处理相应的时间后，弃去原有培养基，每孔加入含10% CCK-8的培养基100 μL，37度环境下孵育1小时，于450 nm波长下检测吸光度。

2.5. 克隆形成实验

取对数生长期的细胞，计数，以800个/孔接种于96孔板中，每3日换液一次，37度5%二氧化碳培养箱中培养2周后，多聚甲醛固定0.5小时，5%结晶紫染色0.5小时，拍照。

2.6. qRT-PCR

MiR-298和TAZ的mRNA表达水平用qRT-PCT检测，利用总RNA提取试剂盒(天根，北京，DP419)，根据说明书提取总RNA。利用miRNA提取分离试剂盒(天根，北京，DP501)提取miRNA。利用cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA (天根，北京，KR103)。利用天根PCR试剂盒(KT201)进行PCR。采用GAPDH和U6分别作为TAZ和miR-298的内参，引物序列详见表1。

Table 1. Primer sequences

表1. 引物序列

2.7. 双荧光素酶报告实验

构建TAZ-WT (含TAZ-WT片段)和TAZ-MUT (含TAZ-MUT片段突变体)的荧光素酶报告载体，使用miR-298 mimics，NC mimics转染HEK293T细胞，48小时后，使用双荧光素酶报告分析系统进行测定。

2.8. WB

使用RIPA提取细胞蛋白，采用BCA定量后，根据样品浓度计算上样量，将样品变性后与loading buffer混合，加入上样孔，进行电泳，随后使用PVDF膜进行转膜，依次进行封闭、一抗孵育、二抗孵育、ECL显色。一抗的货号及稀释浓度分别为β-Actin：CST#3700S 1:1000，TAZ#72804T 1:1000。

2.9. 统计分析

利用SPSS19.0进行数据统计学分析，所有数据以均数 ± 标准差表示，利用单因素方差方法分析，取p < 0.05为具有统计学差异。

3. 实验结果

3.1. miR-298在耐药肺癌细胞中表达下降

为了寻找肺癌发生耐药后的miRNA靶点，我们通过生物信息学技术发现在GES168707芯片中，顺铂耐药病人的肺癌样本与顺铂敏感肺癌病人样本相比，共有11种差异表达的miRNA，其中6种表达下调，5种表达上调，miR-298是其中表达下降的一种miRNA，log2 fold change = 1，pvalue < 0.05 (图1(a))。为了验证miR-298在耐药细胞中表达下降，我们通过顺铂的梯度培养，建立了非小细胞肺癌细胞A549的耐药细胞株。我们发现在肺癌耐药细胞中miR-298表达下调(图1(b)~(d))。以上结果说明miR-298在肺癌耐药细胞中表达下调。

3.2. miR-298可以改善化疗的敏感性并抑制细胞克隆形成

克隆形成实验是检验细胞克隆集落形成的能力，反应细胞的增殖能力。为了验证miR-298在肺癌耐药中的作用，我们利用CCK-8实验以及细胞克隆形成实验检测miR-298 mimics和NC mimics在肺癌耐药细胞中对化疗敏感性的作用以及对细胞克隆形成的影响。我们发现miR-298 mimics可以提高miR-298的表达水平。miR-298 mimics转染后可以一定程度上改善耐药A549细胞的顺铂敏感性，并且抑制耐药A549细胞克隆形成能力的增高。(图2(a)~(e))

3.3. miR-298可以靶向负向调控TAZ

为了寻找miR-298起效的下游靶点，我们通过在线工具预测miR-298的下游靶点发现TAZ是miR-298的潜在的靶基因(图3(a)和图3(b))，双荧光素酶报告实验提示miR-298可以直接与TAZ靶向结合(图3(c))，随后我们用WB检测转染miR-298 mimics和NC mimics后的耐药A549细胞中TAZ表达水平，发现转染miR-298 mimics组TAZ表达水平明显下降(图3(d))。以上结果说明TAZ是miR-298的下游靶点，受到miR-298的负向调控。

Figure 1. MiR-298 is highly expressed in the specimens and cells of drug-resistant lung cancer. (a) There are 11 differentially expressed miRNAs in the GSE168707, of which 5 have increased expression, 6 have decreased expression, and miR-298 has decreased expression. (b)~(d) We established a cisplatin-resistant human non-small cell lung cancer A549 cell line, and we found that the expression of miR-298 in cisplatin-resistant A549 cells was significantly reduced. *Represents p < 0.05

图1. MiR-298在耐药肺癌病人标本和细胞中高表达。(a) 在基因芯片GSE168707中共有11种差异表达的miRNA，其中表达升高的有5种，表达下降的有6种，miR-298表达下降。(b)~(d) 我们建立了顺铂耐药的人非小细胞肺癌A549细胞株，我们发现顺铂耐药的A549细胞中miR-298的表达明显下降。*代表p < 0.05

Figure 2. Transfection of miR-298 improved the cisplatin resistance of drug-resistant A549 cells and inhibited clone formation. (a) Transfection of miR-298 significantly increased the expression level of miR-298 in drug-resistant A549 cells. (b) and (c) Transfection of miR-298 can improve the cisplatin resistance of drug-resistant cell lines. (d) and (e) Transfection of miR-298 inhibited cell clone formation in drug-resistant cell lines. *Represents p < 0.05

图2. 转染miR-298可以改善耐药A549细胞的顺铂耐药性抑制克隆形成。(a) 通过转染miR-298可以明显增高miR-298在耐药A549细胞中的表达水平，(b)、(c) 转染miR-298可以改善耐药细胞株的顺铂耐药性，(d)、(e) 转染miR-298可以抑制耐药细胞株细胞克隆形成。*代表p < 0.05

3.4. 敲低TAZ改善耐药细胞的顺铂敏感性并抑制细胞克隆形成

为了研究TAZ是否调控肺癌细胞的耐药性，我们利用WB实验发现TAZ在耐药的A549细胞中表达明显上升(图4(a))，说明TAZ在肺癌的耐药性生成过程中有重要作用。在耐药细胞中利用TAZ-siRNA和NC-siRNA进行转染，我们发现TAZ-siRNA组TAZ的表达量下降，并且对顺铂的敏感性增高，克隆形成增多(图4(b)~(e))。以上结果说明TAZ在肺癌耐药细胞中起到重要作用。

Figure 3. TAZ is negatively regulated by miR-298. (a) In drug-resistant cell lines, TAZ has a higher level of mRNA expression. (b) Predicted targeting sequence of miR-298 on the 3'UTR of TAZ. (c) The dual luciferin reporter system analysis showed that the fluorescence activity of TAZ-WT cells in the miR-298 group was significantly reduced, showing that miR-298 can target TAZ. (d) WB results showed that the expression of TAZ in the miR-298 transfection group was significantly decreased. *Represents p < 0.05

图3. TAZ受miR-298的负向调控。(a) A549耐药株中，TAZ在mRNA的表达水平更高；(b) 预测miR-298在TAZ的3‘UTR上的靶向序列。(c) 双荧光素霉报告基因显示miR-298组TAZ-WT细胞的荧光活性明显降低，可见miR-298可靶向TAZ。(d) WB结果显示miR-298转染组TAZ的表达量明显下降。*代表p < 0.05

4. 讨论

肺癌作为世界上致死人数最多的癌症之一，一直是临床上十分棘手的问题。吸烟是肺癌最重要致病因素，尽管近些年戒烟观念在民众中普及，但由于空气污染的日益严重，肺癌的发生率仍没有明显降低。顺铂是目前肺癌术后常用的化疗药之一，尽管免疫治疗、靶向治疗的新的治疗手段快速发展，顺铂在

Figure 4. Knockdown of TAZ in cisplatin-resistant cell lines improved cisplatin resistance and inhibited cell clone formation. (a) Transfection of TAZ-siRNA can significantly down-regulate the expression of TAZ. (b)、(c) The cisplatin resistance of drug-resistant cell lines after TAZ knockdown has improved. (d) and (e) The clone formation of drug-resistant cell lines was significantly reduced after TAZ knockdown. * Represents p < 0.05

图4. 敲低顺铂耐药细胞株中的TAZ，可以改善顺铂耐药性，抑制细胞克隆形成。(a) 通过转染TAZ-siRNA，可以明显下调TAZ的表达。(b)、(c) TAZ敲低后的耐药细胞株的顺铂耐药性有所改善。(d)、(e) TAZ敲低后耐药细胞株的克隆形成有明显减少。*代表p < 0.05

肺癌的治疗仍将在未来的很长一段时间中占据着重要地位。顺铂主要通过靶向肿瘤细胞的DNA结构，抑制其分裂。在临床上肺癌的治疗经常会产生顺铂耐药性，细胞产生顺铂耐药性的方式主要有以下三种：药物摄入减少、DNA修复能力增强以及细胞代谢增快。miRNA是目前研究十分广泛的一种短链非编码RNA，自从miRNA被发现以来，短短二十年间miRNA的研究领域得到了很大的扩展，对miRNA在肿瘤领域的深入了解，使得miRNA成为十分有前景的肿瘤治疗和诊断的靶点。研究发现，miRNA在肿瘤耐药性的生成过程中发挥着重要的调节作用。Concetta等 [10] 人报道在胰腺癌发生吉西他滨耐药时，miRNA-217的表达受到明显的下调，上调miRNA-217可以通过调节细胞周期相关因子改善胰腺癌细胞的吉西他滨耐药性。Tao等 [11] 人报道在结肠癌中，外泌体来源的miR-208b与奥沙利铂的耐药性生成密切相关，通过影响调节性T细胞调节肿瘤免疫环境。miRNA在肺癌的耐药性调控中也起到重要作用，潘有光 [12] 等人报道miR-92b在耐药的非小细胞肺癌细胞中表达降低，通过转染miR-92b模拟物可以改善非小细胞肺癌的耐药性。miR-298是一种与肿瘤耐药性密切相关的miRNA，Bao等 [9] 人报道，在阿霉素耐药的人乳腺癌细胞中，miR-298的表达量明显下降。P糖蛋白是一种通过影响阿霉素进入细胞核，从而抑制阿霉素的肿瘤杀伤性的重要蛋白。在耐药的乳腺癌细胞中miR-298的下调伴随着P糖蛋白的下降，miR-298可以直接抑制P糖蛋白的表达，从而调节乳腺癌的耐药性。在本研究中，我们通过生物信息学技术发现miR-298在顺铂耐药的肺癌患者中表达下降，随后我们建立了顺铂耐药的肺癌细胞株，发现miR-298的表达下降。随后我们在耐药的A549细胞株中转染了miR-298 mimics，发现随着miR-298的表达上调，A549细胞的耐药性明显改善，并且细胞克隆形成的能力受到抑制。因此miR-298在肺癌的耐药性中也起到十分重要的作用。随后我们进一步研究了miR-298调节肺癌耐药性的分子机制。我们通过在线工具预测了miR-298的下游靶点，我们发现TAZ是miR-298潜在的靶基因。TAZ是Hippo信号通路的下游效应因子，TAZ通常在肺癌中异常高表达，是肺癌中非常有前景的潜在治疗靶点 [13] 。通过调节TAZ的核转位和稳定性可以影响肺癌干细胞的干性 [14] 。研究发现TAZ在许多肿瘤受到miRNA的调控，Yang等 [15] 人报道miR-125通过靶向TAZ抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭。Yuan等 [16] 人报道在胶质细胞瘤中，miR-125a-5p通过靶向TAZ促进肿瘤细胞分化。但TAZ是否受到miR-298的调控，目前尚未有文献报道。在本次研究中，我们首次发现在耐药A549细胞中，TAZ的表达明显上升，而miR-298可以直接靶向结合TAZ，抑制TAZ的表达，而转染miR-298和TAZ-siRNA，在耐药的A549细胞中可以得到类似的效果，均可以改善顺铂耐药性，以及抑制克隆形成。因此我们认为miR-298可以通过靶向调节TAZ，改善肺癌细胞的耐药性。

但本文有几点明显的不足：一、我们只是进行了基础实验相关的研究，并没有结合临床患者的数据，如肿瘤分期、复发情况、生存周期等因素；二、我们仅在细胞水平进行论证，并未进行动物实验；三、本项目在探讨机制方面有所不足，我们认为miR298通过抑制TAZ产生效应，我们仅仅做了TAZ敲低的实验，并未构建TAZ过表达的细胞株，因此在论证强度上有所不足。因此在未来的研究中，我们应结合更多的临床数据、体内实验以及更完善的机制探讨，更加深入地研究miR298在肺癌中的作用，为肺癌寻找新的治疗靶点。

5. 结论

miR-298在非小细胞肺顺铂耐药的过程中起着重要的调节作用，上调miR-298的表达可以改善顺铂耐药性，miR-298调节耐药性可能是通过靶向抑制TAZ实现的。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。