应激颗粒及其与逆转录病毒的相互作用

Interaction between Stress Granules and Retroviruses

摘要: 逆转录病毒感染严重威胁人类健康，它与疾病发生息息相关，可引起恶性肿瘤和免疫缺陷症。近年来，越来越多的研究表明，逆转录病毒能够通过与应激颗粒(Stress granules, SGs)的相互作用，在病毒感染以及疾病发生过程中发挥重要功能。本文主要总结了应激颗粒的形成和组分，以及逆转录病毒与应激颗粒的相互作用在病毒感染过程中的作用，为研究逆转录病毒感染以及相关疾病的发生提供新的思路。

Abstract: Retrovirus infection is a serious threat to human health. It is closely related to the occurrence of diseases and can cause malignant tumors and immunodeficiency. In recent years, more and more studies have shown that retroviruses can play an important role in viral infection and disease occurrence by interacting with stress granules (SGs). This paper mainly summarizes the formation and composition of stress particles, and the role of the interaction between retrovirus and stress particles in the process of virus infection. It provides new ideas for the study of retroviral infection and the occurrence of related diseases.

1. 引言

在与病毒漫长的对抗过程中，宿主细胞演化出了一系列对抗病毒感染的机制。应激颗粒是哺乳动物细胞在压力环境下，在细胞胞浆中形成的一种可逆动态结构。病毒感染宿主细胞后挟持宿主细胞以完成自身的复制和翻译。病毒感染对于宿主细胞而言是一种强烈的刺激，能够诱导宿主细胞SGs的形成，进而干扰病毒的复制 [1] 。例如在被HCV、RSV和PRRSV等病毒感染的初期，宿主细胞都能够在一定程度上被诱导产生SGs以拮抗病毒的复制 [2] [3] [4] 。因此在病毒感染宿主细胞的过程中，SGs在宿主细胞抑制病毒复制方面发挥重要作用，从而发挥抗病毒功能 [5] 。逆转录病毒是一种含有正向ssRNA的包膜病毒，通过逆转录合成cDNA并整合到宿主基因组DNA上。近年来，越来越多的文献指出许多病毒在感染宿主细胞的不同阶段通过抑制SGs的生成，从而维持病毒自身的复制 [6] 。也有相关报道指出有部分病毒会在复制过程中在一定程度上诱导SGs，进而维持细胞内的平衡。在本文中，我们主要讨论了逆转录病毒对应激颗粒调控的研究进展，为进一步了解逆转录病毒的发病机制以及靶向药物研发提供参考。

2. 应激颗粒

应激颗粒是一种真核细胞在压力环境下(如热刺激、电离辐射、低氧、内质网压力和病毒感染等)，细胞内形成的一种可逆的动态结构 [7] [8] 。SGs最早发现在植物细胞中。在热刺激下，胞浆内会出现包含mRNA以及RNA结合蛋白TIA-1、TIAR、G3BP1等蛋白质凝聚体 [9] [10] 。从上世纪九十年代起，研究者陆续在真核细胞内发现，当细胞受到外界压力时，尤其在病毒感染过程中，翻译起始因子eIF2α发生磷酸化，细胞内出现包含未翻译的mRNA以及其他结合蛋白的可逆相分离。在真核细胞中，SGs的形成往往伴随着mRNA翻译起始的停滞 [1] [11] 。SGs通常包含翻译起始必须的mRNAs，40S核糖体亚基，翻译起始因子(eIF4G、eIF4E、eIF4A、eIF4B、eIF2α等)，以及一些RNA结合蛋白(G3BP1、G3BP2、TIA-1、TIAR，Caprin1等)。尽管大多数SGs作为翻译停滞复合物，其中主要的标志蛋白大致相同，但是根据SGs种类不同，组分也有一定差异 [12] 。

根据真核细胞SGs的发生机制，主要分为经典SGs和非经典SGs。一般认为经典SGs是宿主细胞对抗病毒感染过程中产生的一种结构，包含病毒mRNA，宿主细胞的mRNA以及翻译起始因子，能够抑制病毒的复制 [13] 。而非经典的SGs则仅包含了病毒的mRNA，以便于病毒的复制 [14] [15] 。真核细胞SGs的发生机制具体如下：依赖eIF2α磷酸化的经典途径，和不依赖eIF2α磷酸化的非经典途径，病毒感染宿主细胞的过程主要通过eIF2α磷酸化诱导SGs形成。eIF2α是将启动子tRNA (Met-tRNA ^Met)加载到40S核糖体亚基上的异三聚体eIF2复合体的基本成分。eIF2α被磷酸化后会导致eIF2-GTP-Met-tRNA^Met三元复合物的形成受到抑制，进而诱导SGs的生成 [7] 。在哺乳动物细胞中，目前发现四种能够使得eIF2α磷酸化的激酶，在不同刺激条件下能够被激活，诱导SGs (图1)。PKR (Protein Kinase R)是干扰素反应的组成部分，主要受到dsRNA的调控，例如在病毒感染宿主细胞时，产生dsRNA的病毒RNA复制的中间产物等 [16] ；PERK (PKR-like endoplasmic reticulm (ER) kinase)在内质网应激条件下被激活，与较小的病毒群相关，其中许多病毒表达膜糖蛋白(例如疱疹病毒等) [17] ；HRI (Heme-regulated inhibitor)在氧化损伤和热激条件下被激活 [18] [19] ；GCN2 (General control non-derepressible 2)在紫外辐射和氨基酸缺乏的条件下被激活 [20] [21] 。

Figure 1. The model of classical SGs formation mechanism and formation

图1. 经典SGs形成机制和组分模式图

当外界的不利环境解除、压力消失时，SGs也会在很短的时间内解聚直至最终消失，翻译重新进行 [22] [23] 。在解聚前，胞浆中的SGs逐渐变成颗粒较大、数量较小的形式。Anderson等人的研究表明，SGs的解聚具有一致性，显微镜下观察细胞内的绝大部分SGs是同时被解聚的 [24] [25] 。SGs中某些蛋白的磷酸化对于SGs的解聚是必要的，如FAK会致使Grb7发生磷酸化，从而促进SGs解聚 [26] 。

在病毒感染宿主细胞时，宿主细胞本能的会进行一系列的应激反应。逆转录病毒是RNA病毒的一种，在病毒感染宿主细胞时，进入细胞后，以tRNA为引物，在病毒的逆转录酶的作用下，以病毒正链RNA为模板，合成与之互补的反义DNA链，形成RNA-DNA杂合双链 [27] 。目前研究表明逆转录病毒对于SGs的调控比较复杂，不同种类病毒对于SGs的调控不同，引起的生物学功能也不尽相同。以下就不同种类逆转录病毒讨论其与SGs的调控关系(图2)。

3. HTLV-1与SGs

人类T细胞白血病病毒1型(Human Leukemia Virus type1, HTLV-1)是成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia, ATL)的病原因子，于19世纪80年代从成人T细胞白血病患者的T细胞中分离出来，是第一个被发现与人类疾病相关的逆转录病毒 [28] [29] [30] 。

HTLV-1前病毒包含9032个核苷酸，除了编码Gag、Pol、Env等病毒结构基因外，还编码一系列的调节基因，例如Tax、HBZ、Rex、p12、p13、p30等 [31] 。其中Tax蛋白是HTLV-1病毒编码的重要病毒蛋白，参与调控细胞内多条信号通路，如NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt等，影响肿瘤的增殖与发生 [32] 。近年来有研究指出，病毒蛋白Tax在HTLV-1对SGs的调控中发挥重要功能。Legros等人的研究指出NaAsO₂能够显著诱导Tax出核。Tax从原先的以核定位为主转为全部在胞浆中分布，Tax出核后显著抑制了NaAsO₂诱导形成的SGs。HDAC6能够与G3BP1相互作用，并通过调节运动蛋白的驱动的单个SGs成分沿着微管反向运动，进而协调SGs的组装 [33] [34] [35] 。而Tax能够通过C端结构域与SGs组装的关键调节因子HDAC6的结合，阻碍HDAC6与G3BP1的结合，从而阻止SGs的组装，进而抑制SGs的形成 [36] 。Takahashi等人的研究显示Tax可以与抗应激因子USP10结合，通过与USP10的相互作用，抑制NaAsO₂诱导产生的SGs，进而刺激ROS的产生，诱导ROS依赖的细胞凋亡 [37] ，这也为HTLV-1的治疗提供了新的思路。

4. HIV-1与SGs

人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus Type 1, HIV-1)是一种能够引起艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)的逆转录病毒科慢病毒属的病毒 [38] 。HIV-1起源于中非，20世纪80年代在美国首次被识别，能够选择性地侵犯CD4⁺T淋巴细胞和单核巨噬细胞亚群，是引起获得性免疫缺陷综合征的主要毒株 [39] 。

HIV病毒能够编码病毒结构基因Gag、Pol、Env等。在HIV拮抗宿主细胞应激反应的过程中，Gag发挥重要功能。目前研究显示，在HIV-1感染宿主细胞过程中，病毒编码的Gag对SGs有较大影响。Rao等人的研究发现HIV-1的核衣壳蛋白(Nucocapsid, NC)是Gag前体多聚蛋白pr55Gag的N端蛋白，能够与宿主dsRNA结合蛋白Staufen1相互作用，从而调节病毒复制周期中的几个重要步骤。过表达NC会诱导PKR和eIF2α的磷酸化，在早期减少宿主细胞mRNA的翻译，进而诱导SGs。但是宿主细胞产生的Staufen1能够抑制NC对PKR、eIF2α磷酸化，拮抗NC诱导的SGs的组装、宿主的翻译以及病毒的包装 [40] 。Fernando等人发现Gag末端的NC也可以与宿主细胞的eEF2相互作用，阻断NaAsO₂或PatA诱导的SGs。亲环素A(CypA)稳定了Gag与eEF2的结合。Gag和eEF2的相互作用阻碍了SGs的组装，但随着时间的推移，G3BP1取代了Gag中的eEF2，进而促进了SG的解聚。而对于SGs而言，eEF2的消耗解除了SGs的组装；但是在eEF2缺失的情况下，vRNA在多聚体中重新定位，导致了HIV-1在应激条件下对于SGs组装的抑制能力受到影响。同时在氧化应激条件下，Gag的表达能够抑制ROS的产生，进而拮抗氧化应激带来的影响 [41] 。同时Cinti等人的研究表明Gag可以改变mRNA的帽子结合复合物(Cap-binding-complex)，从而抑制由亚硒酸盐(Se)诱导的SGs。Se通过改变eIF4E的结合蛋白eEFBP1的帽结合活性来抑制翻译起始，从而诱导SGs。而HIV-1的Gag通过与eIF4E的相互作用，从而减少了与5’端帽子相关的低磷酸化的4EBP1的数量，从而抑制Se诱导的SGs。Jorge等人发现HIV-1编码的Nef在HIV-1复制和致病过程中起重要作用。它由完全剪接的HIV-1 RNA翻译而来，其表达在病毒DNA转录和RNA剪接水平上受到内在调节。同时发现Sam68的两个NLS缺失突变体△321和△410，能够通过诱导SGs生成和隔离HIV-1 Nef的mRNA产物隔离，从而抑制HIV-1 Nef的表达，进而促进宿主细胞的存活 [42] 。这表明Nef在在抑制应激颗粒产生过程中扮演重要角色，也为新药研发提供思路。这些研究都指向HIV-1在感染过程中主要依赖对于SGs的抑制，以完成自身正常功能。

5. HIV-2与SGs

HIV-2是20世纪80年代中期从西非患者中分离出来的另一种逆转录病毒，可引起获得性免疫缺陷综合征。其主要分布于西非，但现在已经在美国、欧洲、南非、印度等国家和地区发现，我国也发现少数HIV-2感染病例 [43] 。

HIV-2的致病性较低，这与HIV-2更易受到免疫系统的有效调控有关 [44] 。但是，HIV-1和HIV-2具有相同的致病潜力和建立前病毒状态的能力 [45] 。Ricardo等人的研究揭示了这部分机制可能与这两种病毒对于SGs不同的调控方式相关。与HIV-1对于SGs鲜明的抑制效果不同，HIV-2的表达反而会诱导SGs的组装。HIV-2的表达诱导了含有G3BP1、TIAR以及翻译起始因子eIF4GI和eIF3等经典标记的经典应激颗粒的自发组装。有趣的是，相关研究发现HIV-1能够干扰HIV-2诱导的应激颗粒组装，这表明对应激颗粒组装的调节可以解释两种病毒之间复制的差异。尽管HIV-2诱导应激颗粒的组装与eIF2α的低水平磷酸化有关，但是并不影响宿主细胞的正常翻译过程 [46] 。以上研究表明，在表达HIV-2的细胞中组装应激颗粒可能是病毒复制过程中的重要一步，而不会破坏宿主细胞的正常翻译。这也揭示在逆转录病毒感染宿主细胞的过程中，SGs的存在并不一定完全制约病毒的复制，在一定条件下病毒反而能利用SGs完成自身增殖。

综上所述不同的逆转录病毒与应激颗粒的相互作用不尽相同，但是就目前的文献显示，如HIV编码的NC、Gag以及HTLV-1编码的病毒蛋白Tax都能够抑制宿主细胞形成SGs，表明逆转录病毒更多的通过抑制应激颗粒的形成和组装，籍此来抵消应激颗粒对于复制的影响。但是也有像HIV-2能够自发促进SGs的形成以完成自身复制的现象，表明SGs对于逆转录病毒复制而言并不单纯只有消极影响，也为日后研究逆转录病毒的感染提供了新的思路。

Figure 2. The interaction schematic of SGs and retorviruses

图2. SGs和逆转录病毒相互作用模式图

6. 总结与展望

应激颗粒最初在植物中被发现，在细胞遭遇压力、逆境，尤其在病毒感染方面，对宿主细胞起到一个重要的保护作用。但是近年来，越来越多的研究表明一些病毒也可以通过调控应激颗粒，从而拮抗宿主细胞的翻译抑制，促进自身增殖。本文主要概括了应激颗粒的形成与组分以及逆转录病毒对应激颗粒的调控，旨在阐明逆转录病毒通过应激颗粒对宿主细胞进行调控的机制，为针对于逆转录病毒新药的研发以及通过应激颗粒抑制相关肿瘤的发生提供新的想法和思路。

尽管有相当一部分研究表明逆转录病毒通过调控应激颗粒，从而影响相关疾病的发生，但仍有许多关键问题亟待解决。例如在大多数情况下，SGs的形成都意味着宿主细胞翻译的停滞。而就目前研究来看，逆转录病毒大都能够通过抑制SGs的形成，从而促进自身的增殖。但是HIV-2的表达却能够促进SGs的组装，HIV-2诱导的SGs甚至在病毒复制过程中可能扮演重要作用。这提示了SGs的产生对于有些逆转录病毒而言并不完全是消极因素，部分逆转录病毒在长久的进化中可能逐渐演化出能够利用SGs的机制。而HTLV-1病毒蛋白Tax在表达时能够诱导SGs的形成；但是在NaAsO₂的作用下，Tax却能够反过来抑制SGs的形成。这也暗示SGs可能在病毒复制的不同阶段扮演不同角色，而病毒可能能够利用SGs的动态变化完成自身复制，以达到持续增殖的过程。目前来看，关于逆转录病毒对应激颗粒的调控方面，仍有很大的研究空间，亟需更进一步的研究二者的调控，以便拓宽我们对于逆转录病毒发病机制的了解。

近年来，由于新冠疫情在全世界范围内的肆虐，有越来越多的研究从SGs切入，探究通过SGs靶向多肽促进天然免疫，以达到抗病毒的功能 [47] 。Wang等人研究发现SARS-CoV-2的衣壳蛋白的二聚化区域(SARS-NP)可以靶向液–液相分离，通过抑制Lys63的多泛素化和MAV的聚集，抑制了天然免疫。进而发现干扰肽NIP-V能够靶向SARS-NP，抑制其液–液相分离功能，以达到抑制SARS-CoV-2复制和挽救天然抗病毒免疫的作用 [48] 。Kruse等人报道了人G3BP1/2蛋白和SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白中的ΦxFG多肽基序之间的特异性相互作用，以达到支持病毒复制，并通过其ΦxFG基序N重新连接G3BP1/2相互作用体以破坏应激颗粒。该研究研发出一种基于多肽的抑制剂，破坏G3BP1/2和ΦxFG的相互作用，抑制了SARS-CoV-2的感染 [49] 。这些研究表明通过靶向SGs，对症下药，能够达到抗病毒的效果。但是这方面的研究在逆转录病毒领域鲜有报道，因此深入探究逆转录病毒与SGs的相互作用对相关疾病的治疗与靶向药物的开发，显得尤为重要。

参考文献