赤芍治疗糖尿病视网膜病变的网络药理学研究

Network Pharmacologic Study of Radix Pae-oniae Rubra in the Treatment of Diabetes Retinopathy

摘要: 目的：应用网络药理学研究赤芍治疗糖尿病视网膜病变(diabetes retinopathy, DR)的潜在作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)筛选出赤芍的活性成分及潜在靶点，通过GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank数据库挖掘糖尿病视网膜病变的相关靶点。应用Cytoscape 3.9.1软件构建赤芍成分–靶点相互作用网络图。应用韦恩图获取药物和疾病的交集靶点。将交集靶点上传至metascape，对交集靶点进行GO和KEGG富集分析。对交集靶点进行网络拓扑分析，并应用Cytoscape 3.9.1软件的centiscape插件筛选出关键靶点。结果：共查找到符合筛选条件的药物成分29种，获得潜在靶点99个，共获得疾病相关靶点859个，药物–疾病交集靶点32个；利用网络拓扑分析最终筛选出CASP3、ESR1、AR、TP53、VEGFA、CAT、TNF、AKT1、IL6共9个关键靶点。分析得出赤芍治疗糖尿病视网膜病变的关键靶点主要被富集在AGE-RAGE、HIF-1、PI3K-Akt、Fluid shear stress and atherosclerosis、NF-κB等信号通路。结论：本研究结果初步验证和预测了赤芍对治疗DR的作用机制，为进一步临床验证及药理实验提供参考。

Abstract: Objective: To investigate the potential mechanism of network pharmacology in the treatment of diabetes retinopathy (DR). Methods: The active constituents and potential targets of Radix Paeoniae Rubra were screened out by the Chinese Traditional Medicine System Pharmacology (TCMSP) data-base. The related targets of DR were mined through GeneCards, OMIM, TTD, PharmGKB, and Drug-Bank databases. The drug composition-target interaction network diagram was constructed by us-ing Cytoscape 3.9.1 software. The intersection targets of drugs and diseases were obtained by the Venn diagrams. The intersection targets were uploaded to metascape for GO and KEGG enrichment analysis. Network topology analysis was carried out on intersection targets and the key targets were screened by using centiscape plug-in of Cytoscape 3.9.1. Results: A total of 29 drug ingredients meeting the screening conditions were identified; 99 potential targets and a total of 859 dis-ease-related targets were obtained. There were 32 drug-disease intersection targets. Nine key tar-gets including CASP3, ESR1, AR, TP53, VEGFA, CAT, TNF, AKT1, and IL6 were selected by network topology analysis. The analysis results indicated that the key targets of Radix Paeoniae Rubra in DR were mainly concentrated in AGE-RAGE, HIF-1, PI3K-Akt, Fluid shear stress and atherosclerosis, and NF-κB signaling pathways. Conclusions: The results of this study preliminarily verify and predict the mechanism of action of Radix Paeoniae Rubra in the treatment of DR, and provide a reference for further clinical validation and pharmacological experiments.

1. 引言

随着人们生活水平的提高，糖尿患者的人数逐年增长 [1] 。作为糖尿病常见的微血管并发症，DR是全世界成人和老年人群最常见的失明原因之一 [2] ，对糖尿病患者的视力产生了严重的影响。研究表明，亚洲人群中糖尿病患者DR的患病率约为28%，我国糖尿病患者DR的患病率约为25% [3] 。作为临床上常用的糖尿病患者视力下降的一线治疗方法，激光疗法或者玻璃体内注射血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗体治疗主要针对晚期DR患者，并且存在不良反应多、疗效不确定、成本高昂等弊端。因此我们迫切需要开发安全有效的药物，用以早期控制DR病情，延缓DR进展。

中医药在DR的防治中受到了越来越多的关注。赤芍是我国传统野生中药材，具有清热凉血、活血、祛瘀止痛的功效。现代药理学研究表明，赤芍具有广泛的药理作用，包括抗氧化、抗炎、护肝、神经保护、心血管保护等 [4] ，并且在治疗糖尿病及其并发症方面也被证实发挥着一定的作用。赤芍的主要成分之一芍药苷已被证明可以通过HSP70/TLR4/NF-κB通路改善DR [5] ，对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞也具有保护作用 [6] 。但由于中药具有多成分、多靶点的特点，赤芍治疗DR的作用机制尚不清晰，本研究应用网络药理学的方法，筛选出赤芍主要作用成分及靶点，探究赤芍治疗DR的潜在作用机制，为临床应用提供进一步参考。

2. 材料和方法

2.1. 赤芍活性成分筛选

利用中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP) [7] (https://old.tcmsp-e.com/index.php)查找赤芍所有相关化学成分，综合文献报道，根据药代动力学(ADME) [8] 参数，将药物口服生物利用度(Oral bioavailability OB) ≥ 30%，药物相似性(Drug likeness DL) ≥ 0.18 [9] [10] 作为赤芍活性成分筛选条件。

2.2. 赤芍活性成分作用的靶点筛选

利用TCMSP数据库筛选出赤芍活性成分潜在靶点，在Uniprot数据库 [11] (https://www.uniprot.org/)中将筛选出的潜在靶点名称规范为官方名称(Gene Symbol)，并获取其Uniprot id。

2.3. 赤芍“活性成分–靶点”网络构建

将赤芍活性成分及靶点信息导入Cytoscape 3.9.1软件 [12] ，构建活性成分–靶点网络图。

2.4. DR相关靶点检索

应用检索关键词“Diabetic retinopathy”在GeneCards数据库 [13] (https://www.genecards.org)中将筛选条件设置为Relevance score ≥ 1，获得DR相关靶点499个，在OMIM [14] (https://omim.org/)、TTD [15] (https://db.idrblab.net/ttd/)、PharmGKB [16] (https://www.pharmgkb.org/)、DrugBank [17] (https://go.drugbank.com/)数据库中得到相关靶点分别为232个、30个、187个、3个，对5个数据库中获得的所有靶点信息进行整合，并删去重复值。

2.5. 交集蛋白筛选

将检索出的的赤芍活性成分作用靶点和DR相关靶点利用Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图，获取交集靶点。

2.6. 交集蛋白相互作用(PPI)网络构建及关键靶点的筛选

将所获得的交集靶点导入STRING数据库 [18] (https://cn.string-db.org/)，物种限定为“Homo sapiens”，设置信度为0.4并隐藏游离节点，得到交集靶点相互作用网络，并导出tsv文件。将该tsv文件导入Cytoscape 3.9.1软件中，并利用centiscape插件对相互作用网络进行分析，根据中介性Betweenness、接近度Closeness、自由度Degree筛选出高分靶点，即赤芍治疗DR的关键靶点。

2.7. 交集靶点功能及生物通路分析

将交集靶点上传至Metascape数据库 [19] (http://metascape.org/gp/index)，选择物种为“智人”，Min Overlap设置为3，P Value Cutoff设置为0.01，Min Enrichment设置为1.5，分别进行基因本体(Gene ontology GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG)信号通路富集分析。利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)在线作图工具将GO富集分析得到的生物学进程(Biological Processes BP)、细胞构成(Cellular Components CC)、分子功能(Molecular Functions MF)结果以及KEGG富集分析结果进行可视化呈现。

2.8. 构建成分–靶点–信号通路网络

应用Cytoscape 3.9.1软件，将赤芍活性成分、交集蛋白与号通路信息导入，构建赤芍治疗DR的成分–靶点–信号通路网络。

2.9. 分子对接

将2.1小结和2.6小结中排名靠前的活性成分与核心靶点进行分子对接。在pubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载赤芍活性成分的小分子结构式，再通过Chem3D软件获得稳定分子构象，保存为mol2格式。对于核心靶点的处理是利用PDB数据库(https://www.rcsb.org/)查找并获得对应pdb格式文件，导入PyMol软件进行蛋白受体的初步理，接着在AutoDOck软件中将初步处理后的蛋白受体进行加氢等操作，保存为处理完的受体蛋白。最终的分子对接是用Autodock软件将前面处理好的赤芍活性成分与核心靶点受体进行处理，接着可视化分析的图片是PyMol生成。

3. 结果

3.1. 活性成分筛选

利用TCMSP数据库查找出赤芍化学成分共120种，共筛选出29种满足OB ≥ 30%并且DL ≥ 0.18的活性成分。赤芍活性成分见表1。

Table 1. Bioactive ingredients of Radix Paeoniae Rubra

表1. 赤芍生物活性成分

3.2. 赤芍潜在靶点预测及“活性成分–靶点”网络构建

应用TCMSP数据库查找赤芍29个活性成分对应的潜在靶点，删除TCMSP数据库中找不到潜在靶点的药物成分15个，用Uniprot (https://www.uniprot.org)数据库中的Uniprot KB功能，输入潜在靶点名称，将物种设定为人，并筛选经过校验的(Reviewed/swissprot)的靶点，将潜在靶点名称校正为官方名称(Gene Symbol)。其中有3个靶点(Chitin synthase 2, Cytochrome P450-cam, Beta-lactamase)在Uniprot数据库中查找不到符合条件的基因信息，将其删除。利用Cytoscape3.9.1软件构建出“赤芍活性成分–靶点相互作用网络图”，见图1。图中赤芍活性成分和靶点用节点表示，用边连接活性成分与其对应的靶点。赤芍活性成分节点共14个，靶点节点共99个。

Figure 1. The active ingredient-target figure of Radix Paeoniae Rubra

图1. 赤芍活性成分–靶点相互作用网络图

3.3. 赤芍–糖尿病视网膜病变交集靶点

应用GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank数据库筛选出符合条件的DR相关靶点859个，应用Venny2.1.0绘制出“赤芍-DR交集靶点韦恩图”，如图2。结果示，赤芍与DR之间共存在32个交集靶点。将这32个靶点视为赤芍治疗糖DR的潜在靶点。交集靶点信息见表2。

Figure 2. Venn plot of Radix Paeoniae Rubra targets and DR targets in olibanum

图2. 赤芍-DR交集靶点韦恩图

Table 2. The information of 32 intersection targets

表2. 32个交集靶点信息

3.4. 赤芍–糖尿病视网膜病变交集靶点的相互作用(PPI)网络

将32个交集靶点上传至String数据库，得到“交集靶点蛋白互作(PPI)网络图”，见图3。图中交集靶点用节点表示，用边表示交集靶点间的相互作用。

Figure 3. The protein interaction network of intersection targets

图3. 交集靶点PPI网络图

3.5. 筛选核心靶点

利用Cytoscape 3.9.1软件中的centiscape插件对PPI图中的靶点进行拓扑挖掘，根据Betweenness、Degree等参数进行计算并作图，筛选出CASP3、ESR1、AR、TP53、VEGFA、CAT、TNF、AKT1、IL6共9个具有显著作用的节点，这些节点可能是赤芍作用于DR的核心靶点。见图4。

Figure 4. The protein interaction network of core targets

图4. 核心靶点PPI网络图

3.6. GO富集分析

应用Metascape数据库对赤芍与DR的交集靶点进行GO富集分析。筛选p值最小的前20个富集结果进行展示，见图5。其中BP条目共20个，主要包括：细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、对激素的反应(response to hormone)、蛋白质的磷酸化的正调控(positive regulation of phosphorylation)、细胞对氮化合物的反应(cellular response to nitrogen compound)、管形态发生(tube morphogenesis)、miRNA的转录调控(regulation of miRNA transcription)、腺体发育(gland development)、对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)、腺体形态发生(gland morphogenesis)、对伤害的反应(response to wounding)等，CC条目共4个，包括转录调节复合物(transcription regulator complex)、血小板α颗粒(platelet alpha granule lumen)、受体复合物(receptor complex)、膜筏(membrane raft)，MF条目共9个，包括DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、蛋白质同二聚化活性(protein homodimerization activity)、蛋白酶结合(protease binding)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、核类固醇受体活性(nuclear steroid receptor activity)、通路调节器活性(channel regulator activity)、丝氨酸型内肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、蛋白激酶调节剂活性(protein kinase regulator activity)、肽结合(peptide binding)。上述结果说明赤芍对DR的治疗作用可以通过多种生物学进程、细胞构成及分子功能达到治疗DR的作用。

Figure 5. The histogram of GO analysis

图5. GO富集分析柱状图

3.7. KEGG富集分析

应用Metascape数据库对交集靶点进行KEGG富集分析，将P值最小的前20条富集结果进行可视化呈现，见图6，涉及糖尿病并发症中晚期糖基化产物–晚期糖基化终末产物受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪应力和动脉粥样硬化通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、NF-κB信号通路等。其中AGE-RAGE信号通路与DR相关性最强，核心靶点在AGE-RAGE信号通路中的作用见图7。上述结果提示赤芍可以通过多通路干预DR的病程进展。

Figure 6. The bubble chart of KEGG analysis

图6. KEGG富集分析气泡图

3.8. 成分–靶点–信号通路网络图

应用Cytoscape 3.9.1软件构建出赤芍治疗DR的“成分–靶点–信号通路”网络图，见图8，图中包括14个药物活性成分，32个潜在靶点，涉及18条信号通路，由此可见，赤芍通过多个成分、靶点以及信号通路干预DR的发生和发展。

3.9. 分子对接验证

“成分–靶点–信号通路”网络图提示核心靶点CASP3、VEGFA在关键通路中起着核心作用，选取与之对应的排名靠前的活性成分：黄芩素、鞣花酸、进行分子对接验证，结果显示黄芩素、鞣花酸均能与核心靶点蛋白CASP3、VEGFA形成稳定对接，其结合能均低于−7.0 kcal/mol，表示其结合构型具有强烈的活性，结果见表3，图9。

Figure 7. The role of core targets in the AGE-RAGE signaling pathway

图7. 核心靶点在AGE-RAGE信号通路中的作用

Figure 8. The “components-targets-pathways” network diagram

图8. 成分–靶点–信号通路网络图

Figure 9. The results of molecular docking, Node: (a) baicalein-CASP3; (b) ellagic acid-VEGFA

图9. 分子对接结果。(a) 黄芩素-CASP3；(b) 鞣花酸-VEGFA

Table 3. Molecular docking results

表3. 分子对接结果

4. 讨论

DR是糖尿病最常见的微血管并发症之一，严重影响着人们的视力健康。近年来中药在DR防治中效果显著，尤其在改善DR临床症状方面颇具优势。中医药认为DR病机为“气阴两虚”，逐渐发展到“肝肾阴虚”，最终进展为“阴阳两虚”，病程中存在痰、瘀、郁等致病因素 [20] ，治疗上多以“疏肝泻热”、“活血通络”、“益气养阴”等为原则。赤芍味苦，性微寒，能清热凉血、活血散瘀，应用赤芍治疗DR符合中医辩证用药的原则，已有临床研究表明赤芍组成的方剂对DR疗效显著 [21] 。但是赤芍治疗DR的作用机制及具体作用成分仍有待进一步探讨。

本研究应用网络药理学的方法和理念，对赤芍治疗DR的作用机制进行预测，筛选出赤芍活性成分共29个，与DR相交的靶基因共32个，通过“赤芍成分-靶点-信号通路”调控网络可知黄芩素(baicalein)潜在靶点最多，其次为鞣花酸(ellagic acid)，再次为β-谷甾醇(beta-sitosterol)、(+)-儿茶素[(+)-catechin]、豆甾醇(Stigmasterol)、(2R, 3R)-4-甲氧基-二苯乙烯[(2R, 3R)-4-methoxyl-distylin]、芍药苷(paeoniflorin)、黄芩苷(Baicalin)。黄芩苷和黄芩素是两种酮类化合物，在体内可以相互转化。动物实验发现黄芩素可以通过降低血清中的IL-1β、IL6以及TNF-α的浓度，抑制视网膜中RAGE受体蛋白及ICAM-1黏附因子的表达, 进而抑制核转录因子的NF-κB的激活及炎症因子的释放，减轻糖尿病大鼠早期视网膜组织结构的损害，延缓早期糖尿病大鼠视网膜病变进程 [22] 。Li Pan等 [23] 应用蛋白质组学分析进一步揭示了黄芩素对调节 IL-17信号通路及其上游调节因子IL-1β的作用，并发现黄芩素可以通过限制小胶质细胞和T细胞活化以及慢性视网膜神经炎症在视网膜缺血/再灌注损伤中发挥有效作用。鞣花酸具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以改善胰岛素抵抗，具有降血糖、改善高胰岛素血症的作用 [24] 。研究证明鞣花酸可以通过miR-223/keap1-Nrf2通路改善高糖引起的细胞氧化应激和胰岛素抵抗 [25] ，并且通过动物实验，鞣花酸已被证实可以改善视网膜淤血，干预糖尿病小鼠眼组织病理损害后的炎症，保护糖尿病小鼠眼组织 [26] 。β-谷甾醇是一种具有抗氧化作用的植物甾醇，有综述报道，糖尿病肝病、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病心肌病变等与糖尿病的高糖环境导致的氧化应激有关 [27] 。因此β-谷甾醇的抗氧化作用有控制上述并发症发生和发展的潜力 [28] 。β-谷甾醇可以通过激活脂肪组织中的胰岛素受体(insulin receptor, IR)和葡萄糖转运酶4 (glucose transporter 4, GLUT4)来调节血糖水平 [29] 。Selvaraj Jayaraman等 [30] 研究表明β-谷甾醇通过下调2型糖尿病大鼠脂肪细胞中的IKKβ/NF-κB和JNK信号通路来规避肥胖引起的炎症和胰岛素抵抗。研究发现在糖尿病发展过程中，由于肝损伤血浆中会出现谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的升高，而通过β-谷甾醇和豆甾醇可以降低上述肝酶水平，表明其对肝细胞的保护作用，从而加强肝脏对血糖水平的调控功能。另外己糖激酶是糖酵解中的关键酶，β-谷甾醇和豆甾醇可以通过提高己糖激酶的活性，从而增强葡萄糖的利用。而乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)与己糖激酶类似，活性都可以被β-谷甾醇和豆甾醇增强从而发挥糖酵解的功能，发挥降血糖作用 [31] 。

通过对32个交集靶点的PPI网络进行分析得到9个核心靶点，体现出赤芍治疗DR具有复杂的作用机制，核心靶点按照degree值从大到小排序为CASP3、ESR1、AR、TP53、VEGFA、CAT、TNF、AKT1、IL6，这些核心靶点聚焦于细胞增殖、凋亡、以及氧化应激、炎症反应等方面，在赤芍治疗DR的过程中发挥着重要作用。CASP3被激活后具有抑制DNA修复和执行剪切细胞结构蛋白的作用，直接造成细胞凋亡 [32] 。因此我们推测CASP3可能通过调节细胞凋亡参与DR的病理过程。AKT1与细胞增殖以及迁移等过程有关，高血糖可以引起脉络膜–视网膜内皮细胞系中的VEGFA和PIK3R2的表达增加，使AKT1活化 [33] ，这也说明该信号通路的失调会影响DR的病程进展。ESR1可使胰岛素的敏感性增强，改善糖、脂代谢，当ESR1表达缺陷时可导致胰岛素抵抗 [34] [35] 。TP53在糖尿病的发展中起着重要作用，可以诱导脂肪细胞与胰岛细胞早衰，进而减少胰岛素分泌，加剧血糖失调 [36] 。VEGFA具有增加小静脉血管与微血管的通透性的生理功能，在血管生成过程中起着正向调控作用，抑制VEGFA的表达可影响高糖引起的RF/6A细胞的迁移和管腔形成 [37] 。抗血管内皮生长因子(VEGF)的药物已广泛应用于治疗DR，疗效显著。抗VEGFA和血管生成素-2 (Ang-2)的双特异性抗体Faricimab已在多个国家获批，可以用于治疗糖尿病性黄斑水肿等多种视网膜疾病 [38] 。TNF是脂肪细胞产生的一种蛋白质，分TNF-α和TNF-β两种亚型，其中TNF-α发挥了TNF信号通路中90%的生物功能，TNF-α在炎症反应中扮演着重要的角色。有研究发现TNF-α等可以通过增加血管通透性引起黄斑水肿，还可以导致病理性血管的生成 [39] 。IL6是体内炎症反应和一系列病理生理过程中重要的白细胞介素之一，研究证实IL6可参与胰岛素抵抗 [40] ，并且随着DR患者病变程度加重，DR患者玻璃体中IL6含量增高 [41] ，提示IL6可能参与DR的发生发展。

GO富集分析表明BP主要涉及细胞对化学应激的反应、蛋白质的磷酸化的正调控、miRNA的转录调控、对类固醇激素的反应、对伤害的反应等，CC涉及转录调节复合物、血小板α颗粒、受体复合物、膜筏，MF涉及结合转录因子结合、蛋白质同二聚化活性、蛋白酶结合、细胞因子受体结合等。

KEGG富集分析表明赤芍可以介入多个信号通路干预DR的发展进程，其中AGE-RAGE信号通路可以诱导氧化应激反应，参与DR的发展进程，AGE与RAGE结合之后，RhoA-ROCK信号通路被激活，生成新生血管 [42] 。流体剪应力和动脉粥样硬化信号通路与炎症反应以及转录因子NF-κB、MAPK密切相关，在IL-6、TNF-α等炎症因子以及流体剪应力的作用下，激活后的NF-κB可能会刺激VEGF的表达 [43] 。HIF-1是一种转录激活因子，由HIF-α和HIF-β亚单位组成，已有研究表明高血糖可以引起组织缺氧 [44] ，而在缺氧条件下HIF-α会上调其表达，使机体内氧浓度维持稳定。同时HIF-α是VEGF的关键转录激活因子 [45] 。研究证明应用HIF拮抗剂可以抑制眼部新生血管 [46] 。已有研究报道均表明AGE-RAGE信号通路、流体剪应力和动脉粥样硬化信号通路、HIF-1信号通路等在DR的进程中起到了关键作用，这与本文中KEGG富集分析结果相切合。

分子对接结果说明赤芍中的活性成分黄芩素、鞣花酸与核心靶点CASP3、VEGFA可以稳定对接，进一步验证了应用网络药理学的方法预测的结果具有可靠性。

5. 结论

本研究应用网络药理学及分子对接的方法，探究赤芍干预DR进展的物质基础及作用机制，分析了赤芍和DR之间的关系，研究表明，赤芍可以通过多成分、靶点及信号通路干预DR进展，为赤芍治疗DR的临床应用提供了理论依据。

NOTES

^*通讯作者。