1. 引言
种子生理学家HARRINGTON提出了延长种子保存寿命的双低理论 [1] ，延长了正常性种子的保存寿命，因此，低温低含水量成为保存这类种子的主要方式。而椰子、芒果等热带作物属于顽拗性种子，由于对低温和干燥的敏感性，采用低温低含水量的方法却只能加速种子的死亡，因此目前认为超低温是保存顽拗性种子的最佳手段 [1] 。
米槁(Cinnamomum migao)为樟科樟属的一种常绿乔木，主要分布在我国云南、广西、和贵州的少数地区 [2] 。经药理研究表明，以米槁精油为主要成分的制剂具有抗心肌缺血、镇痛以及扩张冠脉等作用 [3] [4] [5] 。由于人类活动范围的扩张、药物研究开发以及香料市场的需求等影响，导致米槁野生植物种群和数量近年来急剧减少 [6] ，在对米槁进行野生植物资源调查和遗传研究时发现，其种群组成主要为成年大树，野生幼苗极少见，种群年龄结构严重不合理，并且随着种群数量的减少以及生长环境的限制，米槁存在较低的基因流动，使米槁对环境的适应性降低，进一步威胁了米槁野生种群的繁衍 [7] [8] [9] 。2013年，米槁在世界自然保护联盟红色名录中被列为近危(NT)等级，在《中国生物多样性红色名录·高等植物卷》列为濒危物种(中国珍稀濒危植物信息系统(iplant.cn))。在笔者的前期调查和文献查阅中发现，米槁还存在坐果率低、果实有大年小年、种子萌发困难以及不能进行常规的长期保存等因素限制了米槁自然繁育的情况。前期已经有相关的报道对米槁成熟种子的保存做了研究，结果表明米槁的成熟种子在常规保存下很快失活，比较适合米槁保存的方法为低温沙藏，但在保存7个月后，种子活力显著降低 [10] 。笔者以米槁的成熟种子为实验材料，对来自贵州三个种群的米槁成熟种子进行了干燥脱水的萌发实验、种子低温和超低温长期保存实验研究，以期为米槁的种子长期保存提供理论基础。
2. 实验材料、试剂和仪器
2.1. 实验材料收集
实验材料采集于贵州省的三个野生米槁种群成熟种子。运送至实验室后，用手将种子从果皮中取出，并在流动的水下搓洗除去褐色的肉质果皮，并将种子表面的多余水分吸干。米槁成熟种子具体来源见表1。
Table 1. Geographical overview about the population of C. migao mature seeds
表1. 米槁成熟种子来源种群的地理概况
2.2. 试剂和仪器
WPM培养基母液试剂；细胞分裂素(6-BA, 6-Benzylamino Purine)；赤霉素(gibberellins)；植物凝胶(Phytagel)；琼脂；TTC (triphenyltetrazolium chloride)；蔗糖；活性炭(active carbon, AC)；二氯异氰尿酸钠溶(Sodium Dichloroisocyanurate, NaDCC)；75%乙醇；无菌水。
超净工作台；高压灭菌锅；三角瓶；培养皿；组培瓶；镊子；无菌手术刀；酒精灯；无菌滤纸；体视显微镜；烘箱；电子天平；双十五干燥间。
3. 实验方法
3.1. 干燥和储存
所有实验操作均在常温常压下进行。
在103℃下连续干燥17小时后，通过重量法测定随机选择的10粒种子的初始含水量(ISTA, 1996)。种子的干燥是在相对湿度为15%、温度为15℃的室内进行。基于已经测定的种子的重量和初始含水量，将种子干燥至15%、10%和5%三个目标含水量。通过每2小时监测样品重量的减少来确定达到目标含水量时样品的重量，当样品重量达到目标含水量时的重量时，通过用于初始含水量测定的方法来测定样品的实际含水量。
将干燥至目标含水量的种子播种用于发芽，并将胚胎切除用于TTC活力测定和体外发芽。干燥后的种子装入密封罐内放入−20℃的种子库内储存，投入液氮储存的种子则装入冷冻管内后直接投入液氮内，种子均在−20℃种子库和液氮库内储存3个月。然后将冷冻保存的种子取出，在切除胚胎前，放置于室温下，在密闭容器内进行水上吸水48 h，将其胚胎切除用于TTC活力测定和体外发芽。
3.2. 发芽实验
对于新鲜成熟的种子，将20粒种子放在含有200 mg/L赤霉素(GA3)的1%琼脂–水的90 mm培养基中，三次重复。让后放置在25/15℃，光照时间为每天12小时，黑暗12小时。将干燥至含水量15%、10%和5%的种子以及储存了3个月的种子在解冻后也进行上述试验，并对干燥后以及储存的种子还进行了TTC活力测定试验。发芽试验进行12周，连续两周没有种子发芽则终止试验。在终止试验后，将未发芽的种子切开，来确定未发芽的种子是空的、还是腐烂的。
3.3. 离体胚胎的体外发芽试验
将种子外果皮搓洗干净，并用自来水将种子清洗至种皮上无果皮附着物为止，吸干种皮表面水分，先用1‰二氯异氰尿酸钠二水合物溶液浸泡种子，消毒2小时。随后将种子转移至洁净工作台，将对种子消毒的1‰二氯异氰尿酸钠二水合物溶液倒出，倒入约种子体积2倍的75%乙醇消毒5 min。消毒结束后用5‰ NADCC溶液浸泡20 min。再用无菌水清洗三次后将种子放置在培养皿内备用。消毒结束的米槁种子用手术刀和镊子将种皮剥开去除胚胎放置在培养基上，25℃，黑暗条件。胚胎发芽培养基见表2。
Table 2. The medium formulation of C. migao maturation embryo germination
表2. 米槁成熟胚胎发芽培养基配方
计算和统计分析：
初始含水量根据新鲜重量确定为：① MC (含水量) = (FW − DW)/FW × 100%。FW是种子的鲜重；DW是种子干重 [11] 。
② GP (发芽率) = (N − Ni)/N。N是测试发芽种子的总数；Ni是发芽的种子数 [11] 。
③ GPe (胚胎发芽率) = Ng/(Nt − Nc) × 100%。Ng是发芽的胚胎数量；Nt是切除用于发芽的总数量；Nc是被污染的胚胎数量 [11] 。
3.4. 数据统计
所有数据均采用Excel 10.0计算和整理。
4. 结果与分析
4.1. 米槁种子含水量、活力测定和萌发结果分析
从表3可知，从种源地取回来的米槁种子其活力值较高，种子活力均大于80.00%，活力值最高的种子来源于板纳，为100.00%，种子活力最低的来源于坝布，为85.00%。不同来源的米槁成熟种子在脱水后仍保持较高的活力。当脱水至含水量为15%时，最高活力值为88.67% (板纳)，最低活力值为84.21% (坝布)。随米槁种子含水量的减少，当脱水至目标含水量(5.00%)时，种子活力值最低为50.00% (巧乱)，活力值最高的种子为坝布(68.42%)。
采收回来的种子，除去果皮后直接放置在萌发培养基上进行萌发实验，发芽率极低，最高仅为2.22%，而来自坝布的米槁种子未观察到发芽，在观察到发芽的种子中发芽时间也较晚，在培养基上放置6 W后才开始发芽。而进行脱水处理后的米槁成熟种子，所有种源的种子均未观察到发芽。
采收回来的米槁成熟种子在胚轴的离体萌发实验中，具有很高的萌发率，最高萌发率来源于板纳采集的种子为95.00%，三个种源地的萌发率均大于80.00%。随着种子含水量的降低，萌发率逐渐下降，当脱水至目标含水量为15.00%和10.00%时，板纳和巧乱采集的种子胚轴离体萌发率均大于70.00%，来源于坝布的种子离体萌发率则明显降低仅为28.57%和10.34%。当脱水至目标含水量为5%时，坝布和板纳两个种群的胚胎发芽率仍保持大于50.00%的水平，而坝布的种子胚轴离体萌发率为12.50%。从表3可以看出，当米槁成熟种子脱水至一定程度时，不能对其进行种子萌发，但可以将胚轴取出，在无菌条件下进行离体培养，并且在对脱水后的米槁种子进行胚轴活力测定时，胚轴保持较高的活力值，说明米槁种子胚轴具有一定的耐脱水性，而米槁种子的子叶则在脱水后死亡，并且坚硬的种皮也可能是阻碍种子萌发的原因。
Table 3. The viability value, water content, seed germination and ex vivo germination rate of mature seeds from different population
表3. 不同来源的米槁成熟种子不同含水量的活力值、种子发芽率和离体萌发率
4.2. 米槁种子长期保存活力测定和萌发结果
Figure 1. TTC staining results of C. migao seeds after cryopreservation
图1. 米槁种子在经长期冻存后的TTC染色结果
根据3.1的结果米槁种子干燥脱水后的种子萌发率(0%)，经低温和超低温保存的种子不进行萌发实验，仅对其进行种子活力测定和胚轴的离体萌发实验。TTC染色结果见图1。根据染色结果可知，不同含水量的米槁成熟种子在经−20℃和液氮(Liquid Nitrogen, LN)进行长期低温保存后，无论是子叶还是胚轴均不能被TTC染成鲜红色，表明种子生活力很差，通过离体萌发试验发现，经长期低温冻存的胚轴均未能萌发，说明米槁成熟种子在经低温冻存后，其胚轴已经死亡。
5. 讨论
5.1. 脱水对成熟种子活力值和萌发的影响
大量研究表明，成熟种子在经历一定程度的脱水后，种子依然保持较高的活力并能成功萌发 [11] [12] 。虽然米槁种子含水量低至5.29%时仍保持着50%的活力，但对其进行萌发试验结果表明，经脱水后的种子完全不能萌发，这可能与米槁成熟种子具有生理休眠有关。黄小龙对米槁种子的萌发障碍进行研究表明，米槁成熟种子具备完备的种胚结构，不具备形态休眠；内果皮具备吸水透气作用，不存在物理休眠；但存在由于内源抑制物引起的生理休眠，主要与一些可以溶于有机溶剂的酚类、醚类、醛类等有机物有关，且米槁种子的内果皮和种胚均含有不同含量的内源抑制物 [13] 。本研究中对米槁成熟种子进行脱水处理后，提高了单位内米槁种子有机内源抑制物的含量，并且坚硬的种皮也是阻碍萌发的原因之一 [10] ，导致了米槁种子脱水处理后不能进行种子萌发，而取出胚轴后萌发不受影响。
5.2. 低温长期保存在种子保存的作用
对拟南芥茎尖进行超低温保存的研究表明，细胞在液氮的超低温环境下会停止新陈代谢，从理论上说细胞的生活力和形态会保持稳定不变 [14] 。目前，超低温保存作为种质资源长期保存最理想的途径，以种子为保存材料，已经在经济作物 [15] [16] 、观赏植物、中药材 [17] 和林木 [18] [19] 上取得研究成果。含水量是种子进行低温贮藏成功与否的一个关键因素，在对不同含水量的花生种子进行低温贮藏试验表明，含水量 > 15%则会丧失生活力 [20] ，米槁成熟种子在常温贮藏3个月，种子活力显著降低，即使采用沙藏的方式，种子在7个月后活力也显著下降 [10] ，本研究试验结果表明，米槁成熟种子即使脱水至一定程度，胚轴具有活力，但在低温保存后活力丧失，离体萌发试验也未观察到发芽的胚轴，表明米槁成熟种子具有一定的耐脱水性，而不耐低温贮藏。对同属植物樟树进行的试验结果也表明，种子具有一定的脱水耐性，但不耐0℃以下低温保存 [21] 。
6. 结论
本研究以米槁的成熟种子为研究对象，结果表明了米槁成熟种子是不能作为材料直接进行超低温保存的，但是目前超低温保存的技术已经逐渐成熟，在多种植物上取得成功，且用于超低温保存的材料除了种子以外，胚性愈伤组织和悬浮细胞、茎尖类的分生组织以及花粉等均在多种植物上取得成功 [22] [23] [24] 。因此，对米槁种质资源的长期保存还可以对除种子以外的材料进一步研究。
基金项目
国家自然科学基金委员会–贵州省人民政府联合基金项目(U1812403-2)。
NOTES
*通讯作者。