基于网络药理学及分子对接技术探究润肺益肾饮治疗糖尿病肾病的作用机制

Exploring the Mechanism of Runfei Yishen Decoction in the Treatment of Diabetes Nephropathy Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：利用网络药理学方法来探讨润肺益肾饮治疗糖尿病肾病的作用机制。方法：通过TCMSP数据库获取润肺益肾饮的主要化学成分及其靶点，并运用UniProt数据库和SwissTargetPrediction数据库对靶点信息进行矫正和补充；通过Genecards数据库，筛选糖尿病肾病的相关靶点；利用bioinformatics网站，获取药物和疾病的交集靶点；通过Cytoscape 3.9.1软件构建“药物–成分–靶点”网络；采用STRING数据库构建PPI网络，获取关键靶点；对交集靶点进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；此外，通过分子对接实验对核心成分和关键靶点进行对接验证。结果：通过筛选得到润肺益肾饮活性成分56个以及相应的作用靶点630个，得到糖尿病肾病相关的基因靶点1022个，二者共同靶点172个。进一步网络分析显示，主要活性成分为β-谷甾醇、槲皮素、花生四烯酸、啤酒甾醇等；关键靶点为SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、AKT1、EGFR等；KEGG富集分析交集靶点主要富集在AGE-RAGE信号通路中；分子对接结果显示核心成分与核心靶点具有较好的构象。结论：润肺益肾饮对于糖尿病肾病的治疗具有多成分、多靶点、多通路的特点，可能通过抑制炎症、抗纤维化、调控自噬等发挥治疗糖尿病肾病的作用。

Abstract: Objective: this paper uses network pharmacology to explore the mechanism of Runfei Yishen Decoction in the treatment of diabetes nephropathy by network pharmacology. Methods: The main chemical components and targets of Runfei Yishen Decoction were obtained through TCMSP database, and the target information was corrected and supplemented by UniProt database and SwissTargetPrediction database. Through the Genecards database, relevant targets of diabetic nephropathy were screened; use the Bioinformatics website to access targets at the intersection of drugs and diseases; build a drug-ingredient-target network through Cytoscape 3.9.1 software; the STRING database is used to construct a PPI network to obtain key targets. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of intersection targets; in addition, the core components and key targets were verified by molecular docking experiments. Results: Through screening, 56 active ingredients and 630 corresponding targets were obtained, and 1022 gene targets related to diabetic nephropathy were obtained, and 172 common targets were obtained. Further network analysis showed that the main active ingredients were beta-sitosterol, quercetin, arachidonic acid (AA), cerevisterol, etc. The key targets are SRC, STAT3, MAPK3, MAPK1, AKT1, EGFR, etc. The key targets of KEGG enrichment analysis were mainly enriched in the AGE-RAGE signaling pathway. The results of molecular docking showed that the core components and the core targets had good conformation. Conclusion: Runfei Yishen Decoction has the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway for the treatment of diabetic nephropathy, and may play a role in the treatment of diabetic nephropathy by inhibiting inflammation, anti-fibrosis and regulating autophagy.

1. 引言

随着人们的生活方式和生活水平发生的巨大的改变，肥胖已经成为了一个公共卫生问题，随之糖尿病患者也越来越多，流行病学研究表明，2015年成人糖尿病患病率约为8.8%，到2024年这一数字将上升到10.4%。随着糖尿病患病率的逐年增加，糖尿病肾病患者数量也大幅度增多 [1] 。糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病常见的微血管并发症，其临床症状主要为持续性蛋白尿、高血糖、高血压、水肿、肾小球滤过率低，如果不能有效地治疗，最终会发展为为慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease, CKD)和终末期肾病(Endstage Renal Disease, ESRD) [2] 。目前，针对DN的临床治疗仍以控制血糖、降低血压、降低尿蛋白为主，常用DPP-4抑制剂、SGLT2抑制剂、RAAS抑制剂等来降糖、降压、控治蛋白尿 [3] ，但不能有效阻断糖尿病肾病的进展，当发展为终末期肾病，将行肾脏替代疗法，严重影响患者生活质量，加重家庭及社会负担，因此能够有效延缓或阻断DN进展的药物有待开发。

润肺益肾饮是为武汉市中医医院的院内制剂，已有20多年的临床使用记录，在治疗DN方面有着显著疗效，主要成分包括冬虫夏草、茯苓、红参、西洋参、枸杞子。在中医学理论中“肺”“肾”两脏关系密切，现代不少医家主张“肺肾同治” [4] [5] 。而方中冬虫夏草、红参、西洋参均入肺经，在补脾益肾的基础上注重调理肺之功能，以达到补肺阴以滋肾水、肺肾协同调控水液的输布及代谢之效果。现代药理学研究显示，冬虫夏草可降低DN患者蛋白尿，改善肾功能 [6] 。茯苓具有抗炎、抗癌、护肝、调节免疫等药理作用 [7] ，其主要成分茯苓多糖可以抑制肝脏糖异生，能够有效降低2型糖尿病大鼠的血糖水平 [8] ，且对肾脏有保护作用 [9] 。红参、西洋参、枸杞子均有良好的降血糖作用 [10] [11] ，其中，枸杞子的主要成分——枸杞多糖，还可通过抑制NF-κB活化来改善DN的炎症 [12] 。此外，已有临床研究表明，润肺益肾饮能够改善行维持性血液透析的肾脏病患者的微炎症状态，提高其生活质量 [13] [14] 。但润肺益肾饮治疗DN的作用机制尚不清楚，因此本研究采用网络药理分析方法，对润肺益肾饮治疗DN的活性成分和靶点及相关通路进行筛选，并构建了药理学网络，以进一步揭示其分子作用机制，为润肺益肾饮后续研究和临床应用提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 润肺益肾饮的活性成分筛选和潜在靶点的预测

在TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/)中检索润肺益肾饮中的相关药物。在口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(Drug Likeness, DL) ≥ 0.18的条件下，并结合相关文献报道，获得冬虫夏草、茯苓、红参、西洋参、枸杞子的活性成分。通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)逐一检索活性成分的潜在靶点信息，获得相应的药物靶点基因名称。对于其他尚未检索到的活性成分，首先，从PubChem网站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载其化学成分的2D结构并以SDF格式保存，然后逐个提交到SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，以获得相应的化合物靶点。

2.2. DN相关靶点的筛选

以“Diabetic Nephropathy”为关键词，使用Genecards数据库(https://www.genecards.org/)进行检索，获得DN的相关靶点。

2.3. 润肺益肾饮与DN共同靶点的筛选

利用微生信网站(https://www.bioinformatics.com/)，导入药物活性成分的潜在靶点和DN的疾病靶点，得到作用于DN的润肺益肾饮活性成分的预测靶点，并绘制韦恩图。

2.4. 蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)网络构建和分析

将预测靶点基因上传到STRING数据库，将物种限制为“Homo sapiens”，选择得分条件大于0.90的中等置信度，并将分离的蛋白质隐藏在图中，构建蛋白相互作用的PPI网络。然后，使用Cytoscape 3.9.1软件对PPI网络数据进行可视化和分析，并利用CytoNCA插件进一步获取核心靶标。选择介于中心性、接近度中心性和度中心性作为计算PPI网络拓扑特征的参数。

2.5. “药物–成分–靶点”网络构建和分析

将润肺益肾饮中主要药物、活性成分以及交集靶点基因导入到Cytoscape 3.9.1软件中，构建“药物–成分–靶点”网络。

2.6. GO和KEGG途径富集分析

DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)可用于基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)的注释、可视化和集成发现，采用DAVID数据库对潜在靶点进行富集分析。GO富集分析包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)。GO和KEGG的富集结果通过设置P < 0.01获得。

2.7. 分子对接

应用Pubchem数据库获得核心成分的Smile号，再借助Open Babe GUI 2.4.1软件以mol格式保存，从PBD数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心靶标的PDB格式文件。运用分子对接软件对蛋白质进行预处理，进行蛋白质氨基酸残基的修复、加氢加电荷操作、设置力场参数、删除水分子、能量最小化，之后对配体进行能量最小化操作，最后利用AutoDock Vina 1.1.2分子对接软件进行分子对接。对接完成后得到每个蛋白和配体的复合物的对接打分值，打分值越低，配体与受体结合越稳定。

3. 结果

3.1. 润肺益肾饮的活性成分筛选和潜在靶点的预测

经TCMSP数据库检索，以OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18为筛选条件，获取药物活性成分，冬虫夏草7种、茯苓15种、红参4种、西洋参8种、枸杞子31种，其中冬虫夏草、茯苓共有成分为cerevisterol，冬春夏草、枸杞子共有成分为CRL，冬虫夏草、红参、西洋参、枸杞子共有成分为beta-sitosterol，红参、西洋参共有成分为ginsenoside rh2，西洋参、枸杞子共有成分为daucosterol_qt，除去重复成分，最后获取活性成分58种，如表1所示。使用UniProt数据库以及SwissTarget数据库检索活性成分的靶点基因，剔除重复数据后，得到润肺益肾饮靶点基因共630个。

Table 1. The main active ingredients of Runfei Yishen Decoction

表1. 润肺益肾饮的主要活性成分

3.2. DN靶点的预测

利用在Genecards数据库，在keyword中检索Diabetic Nephropathy (糖尿病肾病，DN)，获取疾病靶点3580个，设置Relevance Score > 5，获疾病靶点1022个。

3.3. 润肺益肾饮与DN共同靶点的筛选

将筛选的润肺益肾饮活性成分靶点与DN疾病靶点取交集，并通过微生信软件绘制韦恩图，得到润肺益肾饮与DN的共同靶点172个，如图1所示。

Figure 1. Venn diagram of Runfei Yishen Decoction for the treatment of DN

图1. 润肺益肾饮治疗DN的韦恩图

3.4. 蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)网络构建和分析

将172个共有靶点导入STRING网络平台，构建PPI网络，并用Cytoscape软件进行可视化。去除孤立节点后的PPI网络，由598条边，172个节点组成如图2所示。分析网络中参数信息，根据自由度值将节点进行统计分析及可视化处理，度值排名较高的核心靶点分别为SRC (Degree = 82)、STAT3 (Degree = 74)、MAPK3 (Degree = 64)、MAPK1 (Degree = 62)、AKT1 (Degree = 54)、EGFR (Degree = 50)。如图2、图3所示。

Figure 2. PPI network diagram of Runfei Yishen Decoction in the treatment of DN

图2. 润肺益肾饮治疗DN的PPI网络图

注：(a) 为交集靶点蛋白互作图；(b) 为核心靶点蛋白互作图。颜色深浅、形状大小与自由度值呈正相关。

Figure 3. Protein interaction diagram of Runfei Yishen Decoction in the treatment of DN

图3. 润肺益肾饮治疗DN的蛋白互作图

3.5. “药物–成分–靶点”网络构建和分析

将润肺益肾饮中56个潜在活性成分与172个药物–疾病交集靶点输入Cytoscape软件中，绘制出“药物–成分–靶点”相互作用的网络图。图中紫色代表药物，绿色代表润肺益肾饮中的56种活性成分，橘黄色代表172个共同靶点。网络节点颜色深浅与自由度呈正相关，节点连线越多，表明度值越高，度值排名靠前的活性成分有β-谷甾醇(Degree = 80)、槲皮素(Degree = 37)、花生四烯酸(Degree = 36)、啤酒甾醇(Degree = 35)等。如图4所示。

注：紫色三角形代表药物，绿色圆形代表活性成分，橘黄色菱形代表交集靶点，形状大小与自由度值呈正相关。

Figure 4. “Drug-component-target” network diagram of Runfei Yishen Decoction for the treatment of DN

图4. 润肺益肾饮治疗DN的“药物–成分–靶点”网络图

3.6. GO和KEGG通路富集分析

对172个药物–疾病共同靶点进行GO分析，富集得到生物学过程(Biological Process, BP)、细胞组成(Cell Component, CC)、分子功能(Molecular Function, MF)条目共1006个。以“P > 0.05”为筛选条件，获得具有统计学意义条目448个，其中生物学过程347个，主要涉及MAP激酶活性的调节，细胞增殖、老化及凋亡，ERK级联和MAPK级联的调节，蛋白磷酸化，缺氧反应，炎症反应等；细胞组成20个，主要涉及细胞质膜、囊泡、细胞间隙、细胞质基质等；分子功能81个，主要涉及转录因子活性、DNA结合、血红素结合、酶结合、类固醇结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、ATP结合、蛋白激酶活性等。对药物–疾病共同靶点进行KEGG富集分析的结果显示，共同靶点总共涉及180条代谢通路，共同靶点主要富集到AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、癌症的途径、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌–受体激活、内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖、HIF-1信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎、胰岛素抵抗等。其中，AGE-RAGE信号通路富集分析结果最为显著，在DN的发生发展过程中发挥极为关键的作用。如图5所示。

注：(a) BP富集分析气泡图；(b) MF富集分析气泡图；(c) CC富集分析气泡图；(d) KEGG富集分析气泡图。

Figure 5. Bubble chart of enrichment analysis of DN in the treatment of Runfei Yishen Decoction

图5. 润肺益肾饮治疗DN的富集分析气泡图

3.7. 分子对接

为了验证药物–靶点相互作用的可靠性，将自由度值排名靠前的核心成分(β-谷甾醇、槲皮素、花生四烯酸(AA)、啤酒甾醇)与关键靶点(SRC, STAT3, MAPK3, MAPK1, AKT1, EGFR)进行分子对接验证，若结合能越小，则对接效果越好。所有复合物的结合能均小于−5.0 kJ·mol⁻¹，表明其均具有良好的结合活性，其中利用Pymol软件将对接分数较高的复合物可视化，如图6、表2所示。

注：(a) β-谷甾醇-EGFR；(b) 槲皮素-AKT1；(c) 槲皮素-STAT3；(d) 啤酒甾醇-EGFR；(e) 啤酒甾醇-MAPK3；(f) 啤酒甾醇-MAPK1；(g) 啤酒甾醇-SRC；(h) 啤酒甾醇-STAT3。

Figure 6. Molecular docking model diagram

图6. 分子对接模式图

Table 2. Binding energy of main active ingredients and key targets of Runfei Yishen Decoction

表2. 润肺益肾饮主要活性成分和关键靶点对接的结合能

4. 讨论

糖尿病肾病是一种与代谢相关的复杂病理过程，它不仅对肾脏产生直接损伤，同时也会减缓代谢活动，进而引发其他代谢系统疾病。传统的中医药对DN的显著效果已引起科研工作者的重视，但由于其作用成分与作用机制尚不清楚，限制了它们的运用与推广。因此，我们通过网络药理学的方法预测润肺益肾饮的主要作用成分和其治疗DN的分子机制，为润肺益肾的研究提供参考。

本研究通过“药物–成分–靶点”网络预测润肺益肾饮作用的核心成分，经分子对接验证发现，β-谷甾醇、啤酒甾醇、槲皮素、花生四烯酸与核心靶点对接具有可靠的亲和力。槲皮素是一种具有多种生物活性的类黄酮，现代药理研究表明，槲皮素具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗凋亡等多种生物学功能 [15] 。胡廷彦等 [16] 研究显示，槲皮素可改善肾功能并减弱DN动物模型中的肾脏氧化应激水平和炎症反应。有证据显示，β-谷甾醇、啤酒甾醇均可通过下调MAPK信号传导来减少促炎细胞因子的释放，进而发挥抗炎作用 [17] [18] 。此外，Jayaraman等人 [19] 研究表明，β-谷甾醇能够激活肥胖诱导的2型糖尿病大鼠脂肪细胞中的胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白4 (GLUT-4)来控制高血糖和胰岛素抵抗。花生四烯酸是一种多元不饱和脂肪酸，在人和动物体内广泛存在，在细胞色素P450 (Cytochrome P450, CYP)表氧化酶催化下可生成环氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic Acids, EETs)，EETs能够抗炎、舒张血管、抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞增值以及新生血管生成，许多研究表明 [20] [21] ，EETs可以改善DN的病理改变，减少肾脏细胞凋亡，在延缓DN进展中发挥重要作用。

根据PPI网络图分析结果显示，润肺益肾饮的有效活性成分可能通过SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、AKT1、EGFR等靶点发挥对DN的治疗作用。SRC是细胞蛋白质酪氨酸激酶成员之一，是具有代表性的一种非受体膜结合酪氨酸激酶 [22] ，大量研究表明，SRC通过多种不同的机制促进DN的发病，包括影响系膜细胞增殖、调控肾小管细胞凋亡以及激活肾脏中的多种纤维化信号通路 [22] [23] [24] 。最新研究表明，SRC表达下调可以改善与线粒体完整性受损相关的足细胞损伤从而保护肾脏 [24] 。此外，作为上游靶分子的SRC可介导STAT3、EGFR、PI3K以及AKT活化，导致纤连蛋白表达增加 [22] [25] [26] 。STAT3持续激活时，则会导致组织纤维化 [26] ，已有研究表明STAT3是治疗DN潜在的靶点，可通过减轻肾脏纤维化，延缓DN的进展 [27] 。EGFR通路在DN中被激活，靶向干预EGFR通路可以改善糖尿病神经病变的肾脏结局 [28] 。Rayego等 [29] 报道，活化的EGFR通过激活纤维化相关过程来加速慢性肾脏疾病的损伤。AKT1与DN的免疫调节和炎症反应密切相关，其在基底膜增厚、系膜增殖和足细胞损伤中起着至关重要的作用 [30] [31] 。MAPK1、MAPK3均为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成员之一，当受到细胞因子刺激时，MAPK磷酸化，巨噬细胞浸润，TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-8炎症因子表达上调，引发炎症反应 [32] [33] 。

KEGG富集分析结果提示，AGE-RAGE信号通路为润肺益肾饮治疗DN的主要调控通路，是DN发生发展的重要一环。AGE-RAGE复合物可以特异性激活p21蛋白，刺激细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，其直接或间接产生活性氧(ROS)，诱导多种炎症和纤维化基因表达 [34] [35] [36] 。此外，这些信号通路可以激活NF-κB相关的促炎基因转录，增加了白细胞介素、促炎细胞因子的合成和释放，导致炎症和内皮功能障碍，促进慢性肾脏病的进展 [36] 。

综上所述，本研究采用网络药理学和分析对接技术研究了润肺益肾饮治疗DN的主要靶点和分子机制，发现了润肺益肾饮能够通过多成分、多靶点、多种途径来达到治疗DN的目的，为进一步挖掘润肺益肾饮治疗DN提供了理论依据。鉴于网络药理学和分析对接存在一定的局限性，需要进一步设计合理严谨的药理实验以及临床试验来验证其作用机制。

基金项目

武汉市卫生计生委科研项目(WZ18D21)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。