1. 引言
侧耳科真菌主要以分解植物残体的木质素与纤维素作为它们的营养源，在自然界中对有机物的生态循环起重要作用，多数种类可以食用或药用。侧耳属真菌已经被驯化成功栽培甚至做到了工厂化栽培。中国大陆是平菇主要的生产者，占世界总产量的87%，主要栽培两个种：糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus，俗称平菇)和白黄侧耳(P. cornucopiae，美味侧耳) [1] 。
平菇属于白腐真菌类。白腐真菌通过分泌漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶等降解植物生物质 [2] 。西谷椰子(Metroxylon sagu)果实提取淀粉后的西米废弃物富含纤维质，接种平菇菌种，菌丝生长发酵基质具有很强的漆酶、纤维素酶和木聚糖酶活性 [3] 。糙皮侧耳可分泌相关的水解酶(纤维素酶和半纤维素酶)和降解木素的氧化酶，因而对各类农业和工业的木质纤维素废弃物具有高度的适应性 [4] 。常用各种木质纤维素类废弃物(如玉米芯、甘蔗糖蜜、棉籽壳、废棉、甜菜浆和锯木屑)掺和米糠、麦麸和豆粕作为培养基料。平菇具有生长快速和生物学效率(即新鲜菇产量与基质干重比)高的特性 [5] 。八种木质纤维素类基质栽培平菇试验结果是腐熟非洲白木(Triplochiton scleroxylon)木屑的菇产量183.1 g/kg、稻草(151.8 g/kg)、香蕉叶(111.5 g/kg)、玉米秸秆(87.8 g/kg)、玉米皮(49.5 g/kg)、稻壳(23.3 g/kg)、新鲜非洲白木木屑(13.0 g/kg)和象草(0 g/kg)，表明前两者非常适合平菇生长，产量最高 [6] 。
设施园艺是农业产业结构调整中重点发展的优势产业和农业产业化的重要组成部分，无土栽培是设施园艺的重要内容，基质栽培是无土栽培发展的主要形式，现已成为国内外现代化温室主要栽培模式。食用菌工厂化栽培无疑是一种典型的基质栽培。我国是农牧业大国，拥有丰富的农林生物质资源，其中固体类生物质主要有作物秸秆、畜禽类便、稻壳、薪材、锯末、甘蔗渣、平茬灌木和林业废弃枝条等农林废弃物，其种类繁多、来源广泛、富含大量木质纤维素类物质，这些非食用性生物质不仅贮量丰富，而且生长快、易获得、价格低，极具开发应用价值。可将木质纤维素糖化水解得到葡萄糖、木糖及阿拉伯糖等糖类用于微生物发酵培养基 [7] [8] 。木质纤维素是地球上数量最丰富的廉价可再生生物质资源。木质纤维素包括纤维素、半纤维素和多酚类的木质素3种高分子聚合物，其质量占木质纤维素原料质量的80%~95%，植物茎叶是农业生物质资源木质纤维素的主要成分，是世界上最丰富的可再生资源，约占地球植物干重的1/3~1/2。木质纤维素降解是规模化快速基质生产的关键 [7] [9] 。
木质纤维素类生物质常以水不溶性的高分子聚合物形式存在，不能被直接被真菌细胞吸收利用，真菌需要借助木质纤维素底物诱导胞内纤维素酶基因的大量诱导表达合成木质素氧化酶和纤维素酶等并分泌到生存环境中降解底物大分子。真菌产纤维素酶多为诱导酶，诱导产纤维素酶的主要效应物是水溶性纤维素水解物质，尤其是纤维二糖。乳糖、槐糖等碳源对产纤维素酶的也有诱导作用，但诱导效果不尽一致。利用真菌产纤维素酶发酵生产中，天然纤维素原料可以高效地诱导产酶。目前利用真菌大规模生产纤维素酶时，选择微晶纤维素作为原料，诱导真菌产纤维素酶的效果较好，微晶纤维素虽然能够高产纤维素酶，但成本较高，酶的水解效果不高 [9] [10] 。
在以纤维素为主要碳源基质的菌菇生长过程中，菌丝体产纤维素酶性能是影响菌菇质量的重要因素。利用酸解甜高粱渣水解液能作为产酶促进物质，有效提高菌体产酶能力，对鸡腿菇等食用菌的生长和生理调控可能具有良好的作用 [11] 。微晶纤维素和木质素磺酸钠碳源基质均能诱导香菇纤维素酶基因的表达，且木质素磺酸钠可能具有协同诱导作用 [12] 。平菇菌丝在生长发育中通过分泌多种胞外酶将基质中的纤维素、木质素等水解成小分子物质作为主要碳素营养，其生长分化与分泌胞外纤维素酶的能力大小密切相关 [13] 。平菇菌种在液体培养基中有很强的木质纤维素降解酶产生能力且产酶速度较快 [2] 。
平菇作为第三大商品菇，其工厂化生产程度仍然较低。通常情况下，一千克左右的平菇菌包发菌期长达25~30 d。发菌期长无疑增加了发菌期管理成本，是制约工厂化发展的重要因素。在菌包(棒)的工厂化规模生产环节，可以从两条途径提高菌包的发菌速度。一是内因控制策略，筛选廉价高效诱导物促进平菇菌丝体本身的木质纤维素降解酶大量合成分泌，提高其对农林生物质的有效降解能力，实现菌丝快速生长并转化合成菌菇蛋白；二是外因控制策略，先将富含木质纤维素生物质的基料用木质纤维素酶类降解处理，成为平菇易于快速利用的营养物质，制作的菌包发菌较快。本研究探索了4种木质纤维素酶诱导物缩短平菇菌包发菌期的规律，研究结果能为平菇菌包生产和平菇栽培提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 材料与仪器
平菇I期液体菌种：湖南三农科技有限公司菌种发酵罐中移取平菇6543品种的液体菌种96 h培养物，比平时正常放罐接种提前24 h。液体菌种专用培养基：葡萄糖3%，玉米粉4%，酵母浸粉0.5%，麸皮2%，磷酸二氢钾0.25%，硫酸镁0.1%，维生素B 0.01%，消泡剂0.05%。
菌包：湖南三农科技有限公司自制，以杂木屑(63%)、麦麸(15%)、棉籽壳(10%)、莲子壳(10%)和熟石灰(2%)为原料，用食用菌菌袋窝口机制作平菇菌包，规格是直径10 cm × 高25 cm，每包重量1.5 kg，中央具接种孔。常压蒸汽灭菌24 hr，冷却至室温。
木质纤维素酶诱导物：微晶纤维素(食品级，湖州市菱湖新望化学有限公司)；羧甲基纤维素钠(食品级，重庆力宏精细化工有限公司)；木质素磺酸钠(分析纯，上海伊卡生物技术有限公司)；D-纤维二糖(分析纯，上海安耐吉化学有限公司)。木质纤维素酶诱导物母液制备：分别称取微晶纤维素、木质素磺酸钠、D-纤维二糖溶于去离子水配制成5% (w/v)母液，羧甲基纤维素钠配制成1% (w/v)母液。115℃高压蒸汽灭菌处理30 min。
全自动高压蒸汽灭菌器(登冠)，电热恒温鼓风干燥箱，立式恒温振荡器，洁净工作台，人工气候培养箱(上海一恒)，高速冷冻离心机(卢湘仪)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 微晶纤维素对平菇菌包发菌期的影响
平菇II期液体菌种-W制备：取3瓶各装100 ml I期平菇液体菌种的三角瓶，分别添加灭菌的5%微晶纤维素母液11.1 ml、5.3 ml和2.1 ml，使I期平菇液体菌种中添加的微晶纤维素终浓度依次为0.5% (w/v)、0.25% (w/v)和0.1% (w/v)。将前述含不同微晶纤维素浓度的I期平菇液体菌种、未做处理的I期平菇液体菌种置于恒温振荡培养箱中，25℃下150 r/min培养24 h，得到II期平菇液体菌种-W。
接种与发菌期管理：取灭菌平菇菌包8个，分别接种所制得的含0.5%(w/v)微晶纤维素、0.25% (w/v)微晶纤维素、0.1% (w/v)微晶纤维素处理的II期平菇液体菌种和未做诱导处理的II期平菇液体菌种，接种量为每个菌包注入25 ml，其中15 ml接种到菌包的接种孔内，10 ml接种于菌袋开口端培养料的表面，扎好袋口。各两重复。接种菌包置于28℃恒温培养箱中，袋口向上竖立放置，黑暗培养。跟踪观察发菌过程，记录发菌期时长。发菌期时长为培养起始至平菇菌丝体布满菌包整个料面为止。
2.2.2. 纤维二糖对平菇菌包发菌期的影响
平菇II期液体菌种-X制备：取3瓶各装100 ml I期平菇液体菌种的三角瓶，分别添加灭菌的5%纤维二糖母液11.1 ml、5.3 ml和2.1 ml，使I期平菇液体菌种中添加的纤维二糖终浓度依次为0.5% (w/v)、0.25% (w/v)和0.1% (w/v)。将前述含不同纤维二糖浓度的I期平菇液体菌种、未做诱导处理的I期平菇液体菌种置于恒温振荡培养箱中，25℃下150 r/min培养24 h，得到II期平菇液体菌种-X。
接种与发菌期管理：取灭菌平菇菌包8个，分别接种所制得的含0.5% (w/v)纤维二糖、0.25% (w/v)纤维二糖、0.1% (w/v)纤维二糖处理的II期平菇液体菌种和未做诱导处理的II期平菇液体菌种，接种方法和培养方法同2.2.1。
2.2.3. 羧甲基纤维素钠对平菇菌包发菌期的影响
平菇II期液体菌种-S制备：取3瓶各装100 ml I期平菇液体菌种的三角瓶，分别添加灭菌的1%羧甲基纤维素钠母液11.1 ml、5.3 ml和2.1 ml，使I期平菇液体菌种中添加的羧甲基纤维素钠终浓度依次为0.1% (w/v)、0.05% (w/v)和0.02% (w/v)。将前述含不同羧甲基纤维素钠浓度的I期平菇液体菌种、未做诱导处理的I期平菇液体菌种置于恒温振荡培养箱中，25℃下150 r/min培养24 h，得到II期平菇液体菌种-S。
接种与发菌期管理：取灭菌平菇菌包8个，分别接种所制得的含0.1% (w/v)羧甲基纤维素钠、0.05% (w/v)羧甲基纤维素钠、0.02% (w/v)羧甲基纤维素钠处理的II期平菇液体菌种和未做诱导处理的II期平菇液体菌种，接种方法和培养方法同2.2.1。
2.2.4. 木质素磺酸钠对平菇菌包发菌期的影响
平菇II期液体菌种-M制备：取3瓶各装100 ml I期平菇液体菌种的三角瓶，分别添加灭菌的5%木质素磺酸钠母液11.1 ml、5.3 ml和2.1 ml，使I期平菇液体菌种中添加的木质素磺酸钠终浓度依次为0.5% (w/v)、0.25% (w/v)和0.1% (w/v)。将前述含不同木质素磺酸钠浓度的I期平菇液体菌种、未做诱导处理的Ⅰ期平菇液体菌种置于恒温振荡培养箱中，25℃下150 r/min培养24 h，得到II期平菇液体菌种-M。
接种与发菌期管理：取灭菌平菇菌包8个，分别接种所制得的含0.5% (w/v)木质素磺酸钠、0.25% (w/v)木质素磺酸钠、0.1% (w/v)木质素磺酸钠处理的II期平菇液体菌种和未做诱导处理的II期平菇液体菌种，接种方法和培养方法同2.2.1。
2.2.5. 木质纤维素酶诱导物对平菇子实体产量的影响
前述四种处理的菌包在28℃完成发菌满袋后，将恒温培养箱温度调整到18℃，进行低温养菌4天，各处理菌包表面出现原基。先将菌袋剪掉上端封口，菌包浸泡自来水中吸水10分钟。排袋于室外树荫下出菇，期间多阴雨天，气温14℃左右，培养4~5天收获第一潮菇。称鲜菇湿重，比较分析各处理的第一潮菇产量。
3. 结果与分析
3.1. 微晶纤维素对平菇菌包发菌期的影响结果
接种未做诱导处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期为17天；接种0.1% (w/v)微晶纤维素处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期为13天；接种0.25% (w/v)微晶纤维素和0.5% (w/v)微晶纤维素处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期都为14天。
各样品在发菌期第14天菌丝体生长状况见图1。图1中标号为(a)、(b)、(c)、(d)的样品分别为接种未做诱导处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.1% (w/v)微晶纤维素处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.25% (w/v)微晶纤维素处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.5% (w/v)微晶纤维素处理的II期平菇液体菌种的菌包。从图1中可看出经0.1% (w/v)、0.25% (w/v)和0.5% (w/v)微晶纤维素诱导处理的II期平菇液体菌种接种的菌包都已完成发菌，而未做处理的菌包尚未完成发菌。
Figure 1. Photo of the effects of microcrystalline cellulose on the spawning period of oyster mushroom bags
图1. 微晶纤维素对平菇菌包发菌期的影响结果照片
3.2. 纤维二糖对平菇菌包发菌期的影响结果
接种0.5% (w/v)纤维二糖处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期为13天；接种0.1% (w/v)纤维二糖处理处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期为14天；接种0.25% (w/v)纤维二糖处理的II期液体菌种的菌包发菌期为15天；接种未做诱导处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期为17天。
各样品在发菌期第14天菌丝体生长状况见图2。图2中标号为(a)、(b)、(c)、(d)的样品分别为接种未做诱导处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.1% (w/v)纤维二糖处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.25% (w/v)纤维二糖处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.5% (w/v)纤维二糖处理的II期平菇液体菌种的菌包。从图2中可以看出仅有含0.1% (w/v)和0.5% (w/v)纤维二糖诱导处理的II期平菇液体菌种接种的平菇菌包已完成发菌。
Figure 2. Photo of the effects of D(+)-cellobiose on the spawning period of oyster mushroom bags
图2. 纤维二糖对平菇菌包发菌期的影响结果照片
3.3. 羧甲基纤维素钠对平菇菌包发菌期的影响结果
接种0.02% (w/v)羧甲基纤维素钠处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期为13天；接种0.05% (w/v)羧甲基纤维素钠和0.1% (w/v)羧甲基纤维素钠处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期均为16天；接种未做诱导处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期为17天。
各样品在发菌期第14天菌丝体生长状况见图3。图3中标号为(a)、(b)、(c)、(d)的样品分别为接种未做诱导处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.02% (w/v)羧甲基纤维素钠处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.05% (w/v)羧甲基纤维素钠处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.1% (w/v)羧甲基纤维素钠处理的II期平菇液体菌种的菌包。从图3中可看出仅有经0.02% (w/v)羧甲基纤维素钠诱导处理的Ⅱ期平菇液体菌种接种的平菇菌包完成发菌。
Figure 3. Photo of the effects of carboxymethylcellulose sodium on the spaw- ning period of oyster mushroom bags
图3. 羧甲基纤维素钠对平菇菌包发菌期的影响结果照片
3.4. 木质素磺酸钠对平菇菌包发菌期的影响结果
接种0.5% (w/v)木质素磺酸钠处理的II期平菇液体菌种失去活性，所接种菌包无菌丝体生长；接种0.1% (w/v)木质素磺酸钠和0.25% (w/v)木质素磺酸钠处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期都为13天；接种未做诱导处理的II期平菇液体菌种的菌包发菌期为17天。
各样品在发菌期第13天菌丝体生长状况见图4。图4中标号为(a)、(b)、(c)、(d)的样品分别为接种未做诱导处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.1% (w/v)木质素磺酸钠处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.25% (w/v)木质素磺酸钠处理的II期平菇液体菌种的菌包、接种0.5% (w/v)木质素磺酸钠处理的II期平菇液体菌种的菌包。从图4中可以看出，仅有经0.1% (w/v)和0.25% (w/v)木质素磺酸钠诱导处理的II期平菇液体菌种接种的平菇菌包完成发菌，而经0.5% (w/v)木质素磺酸钠处理的II期平菇液体菌种已经失去活力。
Figure 4. Photo of the effects of sodium ligninsulfonateon the spawning period of oyster mushroom bags
图4. 木质素磺酸钠对平菇菌包发菌期的影响结果照片
3.5. 木质纤维素酶诱导物对平菇子实体产量的影响
菌包完成发菌后，在适宜出菇的天气条件下室外培养5天，出菇情况照片见图5。采摘各菌包生长的第一潮平菇子实体总重量见表1。由表1各处理与对照的比值数据可知，经微晶纤维素(0.1%)、纤维二糖(0.1%)诱导处理所得子实体产量分别高出正常对照组的4%和11%，表明这两种处理方法不仅能缩短菌包发菌期，还对菌包出菇有增产效应。经添加0.1%和0.05%羧甲基纤维素钠诱导处理后，出菇量略低于对照组。木质素磺酸钠诱导处理后菇产量比正常对照显著降低，甚至不出菇，表明该处理不适宜应用于生产实际中。
Table 1. The fruit body yield of each treatment of the oyster mushroom bags and contrast analysis results
表1. 各处理平菇菌包的子实体产量与比较分析
Figure 5. Photo of the fifth day during management of mushroom growing period of oyster mushroom bags placed in the open-air
图5. 菌包室外出菇管理第5天的照片
4. 结论
未经处理的正常液体菌种接种菌包的发菌期为17天。发酵罐中培养平菇液体菌种达到一定的生物量，在菌丝体能用于正常接种前24 h时，向培养物体系中添加一种木质纤维素酶诱导物，继续通气培养24 h，使菌丝体受到适宜浓度的木质纤维素酶诱导物的诱导刺激，再用诱导处理后的液体菌种接种到灭菌菌包，最后进行常规的发菌期管理。添加微晶纤维素的终浓度为0.1%~0.5% (w/v)，能缩短平菇菌包发菌期3~4 d；添加纤维二糖的终浓度为0.1%~0.5% (w/v)，能缩短平菇菌包发菌期2~4 d；添加羧甲基纤维素钠的终浓度为0.02%~0.1% (w/v)，能缩短平菇菌包发菌期1~4 d；或者，添加木质素磺酸钠的终浓度为0.1%~0.25% (w/v)，能缩短平菇菌包发菌期4 d。综合考虑菌包出菇转化率，经各处理的出菇测试，第一潮菇产量测定结果表明微晶纤维素(0.1%)和纤维二糖(0.1%)作为诱导剂，既都能缩短菌包发菌3天，又能提升菇产量4%或11%。
基金项目
湖南省自然科学基金项目(2020JJ6026)；湖南省教育厅资助科研项目(19K030)。
NOTES
*通讯作者。