钙敏感受体在骨肉瘤中的研究进展

Research progress of Calcium Sensing Receptors in Osteosarcoma

摘要: 骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是来源于间充质的恶性骨肿瘤，常侵犯长骨的干骺端，特别是股骨远端和胫骨近端，并易于血行肺转移。随着新辅助化疗的进步，OS患者5年内生存率虽然有所改善，但其远期治疗效果仍不理想，复发转移是OS治疗失败的重要原因。钙敏感受体(CaSR)属于G蛋白耦联受体家族成员，在维持钙离子和细胞内稳态，以及调节多种细胞增殖、分化、细胞凋亡和激素分泌等方面发挥重要作用。CaSR可通过激活或抑制机制为OS的治疗提供新的途径。

Abstract: Osteosarcoma (OS) is a malignant bone tumor originating in the mesenchyme, which frequently damages the metaphysis of long bones, especially in the distal femur and proximal tibia, but also predisposes to blood to lung metastasis. Although patients’ survival has improved in all five years with the advance of neoadjuvant chemotherapy technology, the long-term outcome is unsatisfacto-ry. Because calcium-sensing receptor (CaSR) is an important component of G-protein-coupled re-ceptors, it plays a pivotal role in protecting cells from calcium ions, cell stability, cell growth, differ-entiation, apoptosis, and hormone production. CaSR will open a whole new road to the development of OS, whether by activating or inhibiting mechanisms.

1. 引言

OS是儿童及青少年最常见的骨肿瘤类型，起源于骨形成间充质细胞 [1] 。最常位于长骨干骺端，尤其是在股骨远端或胫骨近端的膝关节周围。与尤文肉瘤类似，OS最常见于青春期男性，高达25%的患者在确诊时会查出已有转移征象，其中肺转移是最常见的部位 [1] 。

钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)是G蛋白耦联受体超家族成员之一，分布广泛，在维持钙离子和细胞内稳态，以及调节多种细胞增殖、分化、细胞凋亡和激素分泌等方面发挥重要作用 [2] 。研究表明，成骨细胞、破骨细胞等骨相关细胞表面都有CaSR，从而感受细胞外钙离子浓度的变化，调节骨重建过程，稳定机体钙平衡 [3] 。

在大多数OS病例中都存在TP53的基因组改变，特别是TP53的失活以及RB失活 [1] 。虽然p53和Rb失活发生在大多数OS中，但相关的突变已经被证明广泛存在。少数突变以高频率反复出现，且只在特定途径内反复改变。通过遗传学和其他临床前研究涉及OS生物学的生物途径包括：PI3K/mTOR、WNT/βcatenin、TGFβ、RANKL/NF-κB和IGF [4] 。遗憾的是，迄今为止，评价靶向药物的临床研究取得了令人失望的结果，现代免疫治疗学的研究也是如此。

2. OS的机制

OS的病因以及发病机制是十分复杂的，但近年来在随着对OS的进一步研究，对OS病因的了解已经取得了重大进展。随着分子生物学理论及技术水平的不断发展和提高，特别是肿瘤分子生物学的发展，OS的发生机制在分子水平上有了一定程度的认识。OS中的SAS，c-fos，c-raf，c-myc等很多癌基因以及抑癌基因p53，Rb，P18 等的异常表达，为OS的基因治疗提供了靶向基因选择的理论基础 [5] [6] 。基因治疗是指用基因工程的方法靠正常和野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中，来代替置换患病或变异基因，进而恢复细胞正常表型的一种治疗方法 [5] 。主要包括选择靶细胞，导入目的基因到靶细胞的基因转移方法，目的基因的正常表达以及目的基因的选择和应用等四个方面。目前应用肿瘤疫苗，导入功能性p53蛋白、p53蛋白衍生物、细胞因子基因、自杀基因、骨钙蛋白启动子等的一系列研究都在OS的基因治疗实验中取得了疗效，特别是在对于肺转移的OS的治疗已经到了临床实验的阶段 [6] [7] [8] [9] [10] 。

3. CaSR概述

CaSR是细胞膜上G蛋白耦联受体，其从牛的甲状旁腺中克隆出，负责Ca²⁺调节的受体 [11] 。CaSR由1078个氨基酸残基的多肽链组成，在结构上由3个功能结构域构成：可结合胞外各种配体的N端胞外结构域、传递各种信号的富含半胱氨酸的七次跨膜螺旋结构域，和将受体与胞内细胞骨架连接的具有调节蛋白激酶磷酸化位点的细胞内羧基末端 [12] 。CaSR活化后通过引起细胞内Ca²⁺浓度增加进而参与多种细胞活动，如细胞增殖、分化和凋亡等。进一步研究发现CaSR的效应发挥还具有组织特异性，涉及多种G蛋白结合和信号通路激活，从而使其成为治疗亲钙性和非亲钙性疾病的有价值靶点 [13] 。

CaSR首次在内分泌腺中被证实存在，即甲状旁腺中 [14] 。之后，其也在心血管系统、消化系统、泌尿系统和骨骼系统中被发现 [15] [16] 。近来研究还发现CaSR在免疫组织和细胞中存在表达。既然CaSR在组织和细胞中表达广泛，因而其也发挥多样的生理、病理作用。在甲状旁腺中，CaSR受循环中血清Ca²⁺的调控从而控制PTH和降钙素的合成与分泌过程 [14] 。

CaSR通过平衡从胃肠道吸收Ca²⁺，参与泌尿系统Ca²⁺的排泄和骨的形成及分解，维持体内Ca²⁺的稳态。研究发现CaSR参与心肌细胞的肥厚、凋亡和心肌纤维化以及血管重构过程，而且在心肌细胞上还发现一种特殊形式的CaSR，在心脏发育、功能和稳态中发挥调节作用。另外，CaSR表达的降低还会导致心肌兴奋–收缩耦联障碍，导致心肌收缩功能降低。在免疫系统中，巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞的CaSR活化不仅可促进炎症细胞因子分泌从而加剧炎症反应 [17] ，且其诱导的大型胞饮作用会促进巨噬细胞的防御功能 [18] 。由此可见，进一步研究与探索CaSR表达与分布有利于对其功能的进一步了解。

4. CaSR和成骨细胞

研究表明：不同类型和分化时期的成骨细胞中都有CaSR的稳定表达，如小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1)，小鼠成骨肉瘤细胞(UMR-106)，人成骨肉瘤细胞(SAOS-2)和人骨肉瘤(MG-63)等。Yamaguchi等 [19] 发现在骨组织微环境中，软骨细胞和成骨细胞中CaSR的活化能够促进骨重建过程。

在MC3T3-E1和大鼠颅盖骨细胞中，高浓度钙离子、新霉素和Gd³⁺等CaSR激动剂，能够促进细胞的分裂、增殖。当导入外源CaSR的互补序列后，细胞增殖作用减弱，说明钙离子等是通过CaSR发挥作用的。此外，Chang等 [20] 利用基因敲除实验发现，在小鼠胚胎发育13 d以前敲除软骨细胞中的CaSR，小鼠胚胎就会死亡；而在胚胎发育16~18 d敲除CaSR，虽然小鼠胚胎能够存活，但是生长板发育减缓。因此，在胚胎发育早期和骨骼形成过程中CaSR发挥关键作用。

成骨细胞中CaSR是通过促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路发挥作用的。在MC3T3-E1中，提高胞外钙离子浓度或使用CaSR激动剂，都会提高P42/44MAPK和p38 MAPK的磷酸化水平，然而c-Jun氨基端激酶(JNK)通路却没有这种变化；而是抑制MAPK，进而抑制磷酸化作用。在小鼠颅骨细胞中，CaSR介导高浓度的钙离子(>5 mmol/L)通过JUN通路，促进细胞增殖 [21] 。钙离子通过CaSR激活MEK/MAPK通路，促进甲状腺激素相关多肽(parathyroid hormone-related peptide, PTHrP)的产生，而PTHrP在绝经性骨质疏松症中具有促进骨形成的作用 [22] 。雷诺酸锶(strontium ranelate)是一种治疗骨质疏松药物，具有促进成骨细胞增殖的作用。研究发现，雷诺酸锶以CaSR作为靶点，至少通过两条通路发挥作用：激活ERK、PKC和PKD通路以及激活p38MAPK通路 [23] 。因此，激活成骨细胞中CaSR，能够促进成骨细胞的增殖、分化和矿化作用。然而CaSR的作用机制仍有待进一步研究。

5. CaSR和破骨细胞

破骨细胞来源于造血单核巨噬细胞，是一种巨大、多核，高度分化的溶骨细胞。核激活因子受体配体(receptor activator of NF-κB Ligand, RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(marcophage colony stimulatingfactor, M-CSF)是破骨细胞形成和分化过程中必需的两个细胞因子。RANKL通过与受体RANK结合，加强了破骨细胞的骨吸收作用，同时促进了破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞的转化过程。CaSR在单核巨噬细胞和成熟的破骨细胞中都有表达，推断其在破骨细胞形成的不同阶段均发挥作用 [3] 。

使用组织特异性的敲除方法，分别敲除掉小鼠未成熟和成熟的成骨细胞上的CaSR，活性检测发现 [20] ，成骨细胞上CaSR的缺失，反而增加了破骨细胞的活性，增强了骨吸收作用。其原因可能是敲除CaSR导致了成骨细胞的RANKL表达量增加 [24] ，说明CaSR在破骨细胞凋亡中发挥作用。溶骨作用使胞外钙离子浓度升高，细胞骨架发生改变。此外，溶骨作用导致血钙浓度上升，从而抑制破骨细胞的溶骨作用。研究发现：高浓度的钙离子(毫摩尔级)，引起破骨细胞快速皱缩，溶骨作用受到严重抑制。而高浓度钙离子抑制破骨细胞是通过钙离子作用于破骨细胞表面的CaSR发挥作用的 [25] 。Kameda等 [26] 在兔成熟的破骨细胞中发现了CaSR的表达，并发现高浓度的钙离子和CaSR激动剂—新霉素和Gd³⁺都会抑制破骨细胞的溶骨作用。然而，高浓度的钙离子既促进成骨作用，又抑制破骨作用的分子机制，有待于深入研究。

6. CaSR和骨肉瘤细胞

OS通常被描述为在肿瘤内部产生混合的成骨细胞/溶骨区。这与许多癌症一样独特，如乳腺癌和前列腺癌，转移到骨并产生主要的溶骨性或成骨细胞病变。成骨细胞被认为是OS的祖先 [27] [28] 。由于OS可能来源于成骨细胞，OS细胞系，如Saos2，经常被许多骨生物实验室用来探索成骨细胞生物学 [29] 。

促进OS细胞凋亡和抑制OS细胞增殖是OS治疗的关键 [30] 。ERK和PI3K-Akt通路通过调节与生长代谢相关的基因表达，在细胞增殖和迁移中起重要作用 [30] [31] 。CaSR通过上调IP3-PLC通路增加细胞内钙离子浓度([Ca²⁺] i) [31] 。Ca²⁺通过激活ERK和PI3K-Akt通路促进细胞增殖 [32] [33] 。已有研究表明，CaSR在正常成骨细胞hFOB1.19和OS细胞MG-63中均有表达，并提示通过上调ERK1/2和PI3K-Akt通路激活CaSR促进OS细胞增殖 [34] 。CaSR激动剂GdCl₃可显著提高MG-63细胞的增殖率 [34] 。因此，CaSR激活或抑制机制的发现将为OS的治疗提供新的途径。

目前已有研究表明，NF-κB通路的激活与OS的发生密切相关 [35] [36] 。核转录因子NF-κB抑制凋亡的作用主要是通过Caspase-8激活的抑制，进而抑制Caspase的级联反应，最终通过抑制Caspase-3介导信号传递途径抑制细胞凋亡 [37] ，NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)可在NF-κB活化通道的不同水平发挥抑制NF-κB的作用，诱导细胞凋亡。PDTC可能通过多种途径调控NF-κB的活性，下调Livin表达，在诱导OS细胞凋亡过程中起重要作用 [38] 。但至今尚未有研究表明CaSR是否通过NF-κB信号通路调控OS细胞，为抑制OS细胞增殖提供新的靶点。

7. 展望

作为维持细胞钙稳态的重要受体，CaSR广泛表达于各种类型的细胞中。CaSR与肿瘤的发生发展过程密切相关，该受体的作用因肿瘤类型的不同而不同。在前列腺癌、肾癌中，CaSR的表达量随肿瘤的恶性程度的增高而增高；在结肠直肠癌和成神经细胞瘤中，随肿瘤的恶性程度的增高而降低，由此CaSR有望成为检测癌症恶性程度和临床等级的一个参考指标。因此，以CaSR作为靶点，利用我国丰富的动植物药物资源，寻找安全、高效的CaSR的激动剂或抑制剂，也将成为预防和治疗骨相关疾病及肿瘤骨转移等疾病的有效途径。

NOTES

^*通讯作者。