不同类型添加剂对猪精液冷冻保存的影响及研究进展

Effects of Different Types of Additives on Cryopreservation of Pig Semen and Research Progress

摘要: 冷冻保护剂是猪精液冷冻稀释液的关键组分，也是影响猪冻精质量的重要因素。冷冻保护剂能够有效缓解冷冻及复苏过程中对精子造成的损伤，对猪精液冷冻效果起到决定性的作用。因此，研究新型冷冻保护剂，可以提高猪精液冷冻保存效果。本文就几种冷冻保护剂的功能以及应用进行论述，以进一步提高猪冷冻精液的质量，发挥其价值，为相关研究以及生产实际应用提供理论参考。

Abstract: The cryoprotectant is a key component of the frozen diluent of pig semen, and is also an important factor affecting the quality of frozen pig semen. Cryoprotectants can effectively alleviate the damage caused to sperm during freezing and resuscitation, and play a decisive role in the freezing effect of porcine semen. Therefore, studying new cryoprotectants can improve the cryopreservation effect of pig semen. This article discusses the functions and applications of several cryoprotectants in order to further improve the quality and value of pig frozen semen, and provide theoretical references for related research and practical production applications.

1. 研究背景

精液冷冻保存技术是随着人工授精技术发展起来的，是动物繁殖生产领域的一个重要里程碑 [1] 。冷冻精液主要有以下几个方面的优点：一是可以减少公畜的饲养量，节约成本；二是有效提高种公畜的利用率，且不受时间、地点的限制；最重要的是可以防止疾病传播，尤其是生殖道疾病。这不仅可以改良家畜品种，也是育种和保护珍惜濒危物种的有效手段 [2] [3] 。牛的冷冻精液试验成功至今约有40多年，在实际生产应用中得到了大力推广。而大量研究发现，猪冻精技术还存在很多难题尚未解决，猪精子对低温刺激比较敏感，导致解冻后的猪精子质膜的完整性以及线粒体活性下降，冷冻效果较差，制约了这项技术的发展及推广应用，其原因主要是解冻后的猪精子活率低、运动能力差、形态异常，导致受胎率较低、产仔数较少，远不及鲜精的效果。制约猪冻精的关键影响因素的是对其抗冻能力以及解冻后受精能力的维持没有妥善解决 [4] 。这就使猪人工授精技术的发展受阻，同时也在一定程度上限制了冷冻精液的商业化生产与应用 [5] 。中国拥有品种丰富的种猪资源，优良种公猪精液冷冻保存的研究及应用对于充分发挥优良种畜的遗传品质和遗传资源的保护具有非常重要意义 [6] 。

直到1949年英国科学家Polge、Parkes等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用，家畜精液长期保存才有了技术上的重大突破。1956年，Polge等首次报道进行猪精液冷冻保存，并进行了人工授精试验 [7] 。但是国内对冷冻精液的研究相对缓慢，一直没有取得突破性进展 [5] 。1990年开始，研究人员在稀释液、冷冻保护剂、冻精剂型、解冻液等方面取得了一些成果，但精子损伤、冷冻–解冻机制等多方面尚不完全清楚，仍处于摸索阶段 [8] [9] 。

冷冻保护剂可以提供一个能防止形成脂类过氧化物的环境，可能是稀释液对维持精子在冷冻保存时影响精子活率的关键因素之一 [10] 。在精子冷冻过程中，冷冻保护剂的选择非常关键，已经有实验证明，使用冷冻保护剂可以提高解冻后精子的存活率 [11] 。一般冷冻保护剂根据其是否可穿透细胞膜分为渗透性和非渗透性两类 [12] 。渗透性冷冻保护剂相对分子质量较小，容易透过细胞膜到达细胞内部，主要包括甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇等，甘油是目前应用最广泛的冷冻保护剂之一 [13] 。非渗透性冷冻保护剂的相对分子量一般较大，主要以单糖、双糖为主，所以在冷冻保存过程中不能渗入细胞内，主要通过增加细胞外液渗透压，促使细胞在冷冻时脱水，减少胞内冰晶形成，从而保护精子免受机械损伤 [14] 。在稀释液中加入此类物质，可以有效降低精子在低温冷冻过程中受到的冷冻损伤，从而提高精子的生物活性。

2. 研究内容

冷冻保护剂是猪精液冷冻稀释液的关键组分，能有效缓解冷冻及复苏过程中对精子造成的损伤，是决定猪精液冷冻效果的重要因素，研发新型冷冻保护剂是提高猪精液冷冻保存效果的有力措施 [9] 。传统的冷冻保护剂为乙二醇(HDO)、卵黄、甘油、二甲基亚砜(DMSO)等。随着研究的不断深入，抗氧化性物质、糖类等也作为冷冻保护剂添加应用并取得了一定的效果。

1) 糖类

近年来，对非渗透性保护剂的研究越来越多，其效果也比较明显。多糖类都有一定的粘性，它能够黏附在精子外围，形成一个小环境，调节周围的渗透压，由此引起细胞脱水，并使得细胞内冰晶的形成更少 [15] 。通过查阅文献，整理了一部分的糖类及其作用，如下表所示：

2) 抗氧化物质

猪精子的细胞膜结构较为特殊，含有大量的不饱和脂肪酸，磷脂酰胆碱含量低，以及胆固醇的分布不均匀，膜外的含量高于膜内等等，使其更容易遭到有氧代谢过程产生的活性氧类(ROS)攻击而发生脂质过氧化反应，进一步造成细胞膜损伤，例如选择通透性降低、细胞内酶类发生泄漏、精子呼吸等生命活动受到抑制等，因此猪精子较其他物种的精子来说，对超低温冷冻更敏感 [9] 。基于以上原因推测得出，在冷冻保护剂中添加抗氧化性物质可起到保护精子的作用。下表中列举了几种常见的抗氧化物质：

3) 其他物质

近年来，研究人员不断尝试在稀释液中添加不同的物质，改善精子外环境的理化性质，提高冻精的品质。具体见下表：

3. 展望

猪精液的冷冻保存技术是推动联合育种、加速中国生猪产业转型的重要步骤，也对保存优质遗传资源、提高种公猪利用率、防止疾病传播等有着重要意义。冻精的远距离运输和长效保存，突破了时空的限制，使养猪生产上可实现精准实时选配；不仅降低了种群维持、引种等成本，更为保护猪种质资源、建立针对人类健康与疾病的遗传改良动物模型基因库等提供了新的方法与思路。然而，解冻后的精子活力、受胎率和窝产仔数方面与鲜精相比，仍存在差距(窝产仔数大概相差0.5头左右)。该技术的关键在于减少精子在冷冻过程中的损伤、提高解冻后精子的活性和生殖能力以及对冷冻程序进行优化。随着未来在新的冷冻保护剂的研发和配方的优化上研究的逐步深入，猪冷冻精液的推广和使用势必发展迅速。

参考文献