1. 背景
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种进展性神经退行性疾病，也是我国老年人痴呆中最常见的原因。AD的ε4，ApoE ε4)等位基因是AD的危险因素之一 [1] 。ApoE ε4携带者在认知减退和神经退行性变中具有较快的速度 [2] 。ApoE ε4亦会选择性地破坏突触可塑性，加速神经元变性 [3] [4] 。
目前脑脊液突触生物标志物的评估取得了进展，其中脑脊液生长相关蛋白-43 (Growth-associated protein-43, GAP-43)在学习和记忆存储中起重要作用。GAP-43是一种突触前蛋白，主要在海马体和相关皮层中表达 [5] ，参与轴突生长、突触可塑性以及学习和记忆功能的调节 [6] 。有证据表明，脑脊液GAP-43浓度在AD中升高 [7] ，基线水平的脑脊液GAP-43水平与t-tau、p-tau以及认知能力等有较强的相关性 [8] [9] [10] ，脑脊液GAP-43已被证实有可能成为AD突触功能障碍的候选生物标志物。
目前已有GAP-43与ApoE ε4在基线水平的研究，然而关于脑脊液GAP-43的纵向变化与ApoE ε4的研究目前较缺乏，临床极需明确。因此我们分析了阿尔茨海默病神经影像计划中(Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative ADNI)轻度认知障碍(Mild Cognitive Impairment MCI)受试者中ApoE ε4、GAP-43与认知及神经变性的相关性。
2. 对象与方法
2.1. ADNI数据库
本文中使用的数据均来自ADNI数据库。ADNI于2003年作为公私合作伙伴关系启动，由首席研究员Michael W. Weiner博士领导。该数据库是由国家生物医学成像和生物工程研究所、食品和药物管理局、私营制药公司和非营利组织赞助的纵向多站点研究。目的是开发用于早期检测和跟踪AD的临床，成像，遗传和生化生物标志物。ADNI个体从美国和加拿大的50多个地点招募。所有参与机构的医学伦理委员会都批准了ADNI。
2.2. 参与者纳入及分组标准
在ADNI数据库中，我们纳入了164名年龄在55至90岁之间并完成2年随访的MCI参与者，MCI的诊断基于认知评估。
纳入及分组标准
参与者至少有一个ApoE ε4等位基因被视为ApoE ε4携带者，且均完成腰椎穿刺，临床和神经心理学评估，磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging MRI)。MCI的诊断标准为记忆功能受损，经教育评分校正后的韦氏记忆量表逻辑记忆II评价证实存在客观记忆力减退，简易精神状态检查量(Mini-Mental State Examination, MMSE)分数在24至30之间，临床痴呆评定量表(Clinical Dementia Rating, CDR)分数为0.5，日常生活活动保留，没有痴呆。
2.3. 脑脊液标记物检测方法
2.3.1. GAP-43
使用酶联免疫测定(enzyme-linked immunoassay ELISA)方法分析脑脊液GAP-43。ELISA由小鼠单克隆GAP-43抗体NM4和多克隆GAP-43抗体与C-末端表位联合开发。使用来自瑞典M�lndal Sahlgrenska大学医院神经化学实验室临床常规的脑脊液样本评估ELISA的性能。分析由委员会认证的实验室技术人员在盲法下进行。
2.3.2. 脑脊液中的其他生物标志物
使用多个xMAP-Luminex平台和Innogenetics inno-bia AlzBio3免疫测定试剂用于测量脑脊液Aβ、总tau和p-tau。更多详细数据可见https://adni.loni.usc.edu/data-samples/access-data/。
2.4. 认知评估
在记忆方面，采用ADNI记忆量表(ADNI Memory, ADNI-MEM)和阿尔茨海默病测序项目表型协调联盟记忆量表(Alzheimer’s Disease Sequencing Project Phenotypic Harmonization Alliance Memory, ADSP-PHC-MEM)。在语言方面，采用阿尔茨海默病测序项目表型协调联盟语言量表(Alzheimer’s Disease Sequencing Project Phenotypic Harmonization Alliance Language, ADSP-PHC-LAN)。在执行方面，采用阿尔茨海默病测序项目表型协调联盟执行功能量表(Alzheimer’s Disease Sequencing Project Phenotypic Harmonization Alliance Executive Functioning, ADSP-PHC-EXF)和ADNI执行功能量表(ADNI Executive Functioning, ADNI-EF)。阿尔茨海默病评估量表–认知量表(Alzheimer Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale, ADAS-Cog)评估认知。并且还使用听觉语言学习测试(Rey Auditory Verbal Learning Test, RAVLT)来衡量学习和记忆。同时，我们收集了社会活动功能量表(Functional Activities Questionnaire, FAQ)。
2.5. 结构磁共振
用海马、脑室容积、中颞体积等来评估神经退行性变，结构成像使用3.0-特斯拉磁共振成像扫描仪，使用FreeSurfer 5.1版对NiFTI格式的T1加权图像进行区域体积量化，这些数据根据总颅内容量进行调整。更多详细数据可见https://adni.loni.usc.edu/data-samples/access-data/。
2.6. 统计方法
对于基线人口统计学信息，分类变量采用卡方检验，连续变量采用曼–惠特尼U检验。斯皮尔曼相关分析检验ApoE ε4是否影响GAP-43水平与脑脊液核心生物标志物及认知、脑区体积之间的关系。脑脊液GAP-43水平与认知水平、脑区体积之间的纵向关系采用线性混合效应模型评估。我们将脑脊液GAP-43水平、认知量表评分、脑区体积进行Z转换来确保数据的正常。
所有检验均为双边检验，统计学意义设定为P < 0.05。所有统计均使用R 4.1.2和IBM SPSS Statistics 26执行。
3. 结果
3.1. 人口统计学特征
本研究共纳入了164名受试者，其中78名ApoE ε4非携带者，86名ApoE ε4携带者。受试者的年龄、教育等基础信息和基线水平的生物标志物特征如表1所示。结果所示年龄和教育水平没有差别。在基线水平，ApoE ε4携带者的脑脊液t-tau、p-tau和GAP-43水平均显著高于ApoE ε4非携带者(P < 0.05)，Aβ显著低于ApoE ε4非携带者(P < 0.05)。
Table 1. Demographic information for each group
表1. 各组人口统计学信息
3.2. 纵向阶段脑脊液GAP-43的变化
在随访阶段，脑脊液标记物的变化如表2所示。两组脑脊液GAP-43都随时间增加，ApoE ε4非携带者为15.94 pg/(mL·月)，ApoE ε4携带者为15.14 pg/(mL·月)，但是并没有发现GAP-43增长率有统计学意义。随访2年后，ApoE ε4携带者的脑脊液GAP-43含量仍明显高于ApoE ε4非携带者(P = 0.002)。
Table 2. Biomarker comparison after 2 years of follow-up
表2. 随访2年后生物标记物比较
3.3. 脑脊液GAP-43水平与脑脊液核心生物标志物的相关性
脑脊液 GAP-43在基线和纵向水平与核心生物标志物的相关性如表3所示。在基线水平，无论是否携带ApoE ε4基因，脑脊液GAP-43与t-tau和p-tau均有较强的相关性，而与Aβ没有相关性。在随访期间内GAP-43的变化率与t-tau和p-tau的变化率有较强的相关性，与Aβ的变化率没有相关性。
Table 3. Association of AD biomarkers with CSF GAP-43 baseline and longitudinal levels
表3. 脑脊液核心生物标志物与脑脊液 GAP-43基线和纵向水平的关联
3.4. 脑脊液GAP-43与认知量表、脑区体积的相关性
脑脊液GAP-43在基线和纵向水平与认知量表的相关性如表4所示。在基线水平，ApoE ε4携带者的GAP-43与ADNI-MEM、ADNI-EF、ADAS-Cog13、PHC-MEM、FAQ等认知量表存在相关性。在随访阶段，这些认知量表亦与脑脊液GAP-43水平存在相关性。
基线水平没有发现脑脊液GAP-43与各脑区体积存在相关性。而基线水平的脑脊液GAP-43与2年后的中颞体积存在相关性(表5)。
Table 4. Correlation of cerebrospinal fluid GAP-43 with cognition at baseline and follow-up
表4. 脑脊液GAP-43与认知在基线和随访阶段的相关性
Table 5. Correlation of cerebrospinal fluid GAP-43 with brain region volume at baseline and follow-up phases
表5. 脑脊液GAP-43与脑区体积在基线和随访阶段的相关性
4. 讨论
研究发现，在基线以及随访阶段，ApoE ε4携带者的脑脊液GAP-43水平高于ApoE ε4非携带者。在基线水平，无论是否携带ApoE ε4基因，脑脊液GAP-43与t-tau和p-tau有较强的相关性。基线水平的脑脊液GAP-43与较差的认知功能有相关性仅在ApoE ε4携带者中发现。在随访期间内，GAP-43的变化率与t-tau和p-tau的变化率亦有较强的相关性。同时，基线脑脊液GAP-43可以预测认知和神经退行性变的进展。
突触功能障碍是许多神经退行性疾病中最早可检测到的变化之一，甚至可能早于神经元变性，因此突触功能障碍在AD病理中的重要作用促进了突触蛋白的分析和定量 [11] [12] 。GAP-43是突触可塑性和轴突再生的调节因子，GAP-43水平升高由突触损伤诱导，本研究发现随访阶段ApoE ε4携带者和ApoE ε4非携带者中脑脊液GAP-43含量均高于基线水平，这也进一步说明突触破坏逐渐加重 [13] 。有研究表明，不同ApoE等位基因在调节突触可塑性和修复方面存在差异。ApoE ε4会抑制轴突的伸展，使得神经元的修复受阻，进而加剧了神经元的死亡 [14] 。也有研究表明ApoE ε4与突触功能调节因子表达减少密切相关 [15] 。本研究发现在基线和随访阶段，ApoE ε4携带者的脑脊液GAP-43水平均高于非携带者，这与先前研究一致，说明ApoE ε4影响了突触的完整性。但是在随访期内MCI的ApoE ε4携带者与非携带者的脑脊液GAP-43水平的变化无统计学差异，这可能由于我们的随访时间较短且脑脊液GAP-43的变化比较温和，单位时间内ApoE ε4对脑脊液GAP-43的影响变化并不能检测。
在本项研究中发现，基线水平的脑脊液GAP-43与p-tau、t-tau相关，随访阶段GAP-43的变化与t-tau和p-tau的变化存在正相关。既往有研究表明，不同病理分组下脑脊液GAP-43与t-tau、p-tau均存在相关性 [9] [10] [16] 。tau蛋白存在于MCI和AD患者的突触后末梢中，脑脊液中tau蛋白增加可能是突触前-突触后功能障碍或存在原发性突触后损伤 [17] 。GAP-43与t-tau和p-tau之间的相关性可能反映了GAP-43与tau病理学之间的共同致病过程。但是本研究中并没有发现GAP-43与Aβ存在相关性。根据淀粉样蛋白级联假说 [18] [19] ，Aβ启动tau病理，而tau病理导致神经元功能障碍和细胞损失，Aβ通过tau病理引发突触功能障碍。如果没有tau病理的存在，就不会导致突触功能障碍。这可以部分解释为GAP-43所反映的突触功能障碍可能与tau病理密切相关，而与脑脊液Aβ病理无明显相关性。
大量的突触缺失可能导致神经退行性变，导致认知障碍 [20] [21] [22] 。在我们的研究中发现，与ApoE ε4非携带者相比，ApoE ε4携带者的脑脊液GAP-43与ADNI-MEM、ADNI-EF、ADAS-Cog13、PHC-MEM、PHC-LAN、FAQ均存在相关性。先前有研究分析基线水平的GAP-43与认知(MMSE)的相关性，但本研究采用更全面的认知量表(ADNI-MEM，ADNI-EF，ADAS-Cog13，PHC-MEM，FAQ等)进一步探究脑脊液GAP-43与认知子领域的相关性 [8] 。考虑到随访时间较短，本研究合并基因型后进行纵向分析。研究发现GAP-43与认知的相关性不仅存在整体认知功能中，在记忆、执行、语言等子领域亦存在相关性。突触功能障碍是AD所致痴呆的重要病理改变，脑脊液GAP-43是神经元传递和突触可塑性必不可少的，MCI患者脑脊液GAP-43升高可能是突触功能障碍导致的渗漏 [23] ，因此它们的变化可能反映了认知能力下降的早期迹象 [24] [25] 。
本研究还评估了脑脊液GAP-43是否与反映神经退行性变的磁共振结果有关。在基线水平并没有发现脑脊液GAP-43与脑区体积存在相关性，随访期间GAP-43的变化与颞叶萎缩存在相关性。有研究表明在神经影像学上，高水平的脑脊液GAP-43与较小的海马和内侧颞叶体积有关，并与海马和内侧颞叶体积随时间快速萎缩相关 [11] 。另外一项荟萃分析报告了ApoE ε4携带者会有更严重的海马萎缩，ApoE ε4会导致神经元丢失，海马萎缩主要是由于海马内神经元细胞的损失 [26] 。未来，我们可以收集大量数据进一步研究和探索脑区体积与生物标志物之间的关系，为病因和发病机制目前尚不清楚，但全基因组研究表明，载脂蛋白E ε4 (Apolipoprotein E)生物标志物在AD临床研究和实践中的潜在作用提供更多证据。
本研究存在以下局限性，由于ADNI队列主要是来自欧洲和美国的志愿者，因此在解释数据时应考虑样本选择偏差。本研究仅对MCI进行了研究，所获得的结果有需进一步在整个AD群体中研究。
5. 结论
在MCI个体中，ApoE ε4可能会影响脑脊液GAP-43水平，脑脊液GAP-43对认知功能、神经退行性变的影响可能与ApoE ε4状态有关。同时脑脊液GAP-43作为一种突触生物标志物可用于追踪MCI的进展。
基金项目
该研究由山东省重点研发项目(2018GSF118235)和国家自然科学基金(第81571234号)资助。
NOTES
*并列第一作者。
#通讯作者Email: bamaowen@163.com