摘要: 以云南当地常见9种食用野生菌为原料，包括鸡油菌、老人头菌、青头菌、谷熟菌、珊瑚菌、黄牛肝菌、黑牛肝菌、见手青、白葱菌，参照GB 5009.84-2016和GB 5009.85-2016方法和条件，测定9种可食用野生菌中维生素B1、B2的含量，比较新鲜野生菌与烘干后野生菌中维生素B1、B2含量变化，以及对同温度下存放不同周期的野生菌中维生素B1、B2含量进行分析。结果表明，9种可食用野生菌中都含有维生素B1、B2，但烘干后的野生菌中维生素B1、B2的含量远高于新鲜的野生菌，是新鲜野生菌的2~10倍。在同温度下存放不同周期的野生菌中维生素B1会随着存放周期增长而降解，维生素B2却非常稳定，不易被氧化。这为野生食用菌资源的进一步开发利用提供了理论依据。
Abstract:
Using 9 common edible wild mushrooms in Yunnan as raw materials, including Cantharellus cibarius Fr, Catathelasma ventricosum, Russula virescens (Schaeff.) Fr, Russula virescens, Ramaria botrytoides, Boletus speciosus, Boletus brunneissimus, Boletus luridus, and Boletus riegius Krombh. Referring to the methods and conditions of GB 5009.84-2016 and GB 5009.85-2016, the content of vitamin B1 and B2 in 9 edible wild mushrooms was determined, the vitamin B1 and B2 content between fresh and dried wild mushrooms was compared, and the content of vitamin B1 and B2 in wild mushrooms stored at the same temperature for different cycles was analyzed. The results showed that all 9 edible wild mushrooms contained vitamin B1 and B2, but the content of vitamin B1 and B2 in dried wild mushrooms was much higher than that of fresh wild mushrooms, which was 2~10 times higher than that of fresh wild mushrooms. Vitamin B1 in wild mushrooms stored at the same temperature for different cycles will degrade as the storage cycle increases, while vitamin B2 is very stable and not easily oxidized. This provides a theoretical basis for the further development and utilization of wild edible mushroom resources.
1. 引言
野生菌，又称蘑菇、蕈，是一类大型真菌，全球已知野生食用菌2500余种，我国已知约1000种，云南有近880种 [1] [2] [3] ，约占世界食用菌物种的36%，占全国的90%。云南复杂的地形地貌，多样的森林类型、土壤种类以及独特的立体气候条件，孕育了丰富的野生食用菌资源，且种类多，分布广，产量大。
野生菌富含多种维生素、优质蛋白及其它有益于人体的成分，营养丰富，风味独特，有的食用菌还有治癌症和多种疾病的药理作用 [4] 。其中组成蛋白质的氨基酸种类也十分齐全，约有十七八种，尤其是人类必需的八种氨基酸 [5] [6] [7] ，几乎都可以在野生菌中找到。丰富的蛋白质提供鲜味，这也是野生菌口味鲜美的奥妙所在。野生食用菌的营养价值之所以高，还在于它含有多种维生素，尤其是水溶性的B族维生素和维生素C [8] [9] ，脂溶性的维生素D含量也较高，还有丰富的糖类化合物 [10] [11] ，同时野生菌中多糖具有潜在的免疫调节活性，可作为预防肾癌的有效治疗药物 [12] [13] 。野生菌中的铁、锌、铜、硒、铬等含量较多 [6] [7] [14] ，经常食用野山菌既可补充微量元素的不足，又克服了盲目滥用某些微量元素强化食品而引起的微量元素外流，还能够增强自身的免疫力和抗病能力。
维生素B1又称硫胺素或抗神经炎素，维生素B2又称核黄素，维生素B1、B2是人体必需维生素之一，参与人体能量代谢和维护神经生理活动 [15] [16] 。食用菌中维生素B1、B2的检测主要参照食品安全国家标准 [17] [18] 。检验方法主要有分光光度法 [17] [18] 、高效液相色谱法 [17] [18] [19] [20] 、液相色谱–串联质谱法等 [21] 。
目前，这九种野生食用菌在云南本地食用菌市场上比较常见，产量较大，受本地人喜爱。为更好地利用这九种特色野生食用菌，本文针对野生菌中营养成分维生素B1和维生素B2含量进行测定及分析，以期能对野生食用菌进一步的研究与开发利用提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 试剂与仪器
野生菌(鸡油菌、老人头菌、青头菌、谷熟菌、珊瑚菌、黄牛肝菌、黑牛肝菌、见手青、白葱菌)本地市场采(采购数量各500 g)；甲醇：色谱纯，德国默克集团；乙酸钠：分析纯，四川西陇化工有限公司；正丁醇：分析纯，广东光华科技股份有限公司；铁氰化钾：分析纯，四川西陇化工有限公司；氢氧化钠：分析纯，四川西陇化工有限公司；盐酸：分析纯，重庆川东化工有限公司；水：18.2 ΜΩ超纯水，赛多利斯超纯水机；木瓜蛋白酶：酶活力 ≥ 800 U/mg，ACROS；淀粉酶：酶活力 ≥ 3700 U/g，SIGMA；维生素B1标准物质：阿尔塔；维生素B2标准物质：上海安谱。
LC-20高效液相色谱仪：日本岛津公司；色谱柱：C18，5 μm，4.6 × 250 mm，Spolar HPLC PACKED COLUMN；0.1 mg和0.01 mg分析天平：瑞士梅特勒公司；TGL-20B高速离心机：上海科学仪器厂；KQ-800DE超声清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；涡旋震荡器：广州台宁科技有限公司；恒温振荡器：CRYSSTAL；烘箱：上海跃进医疗器械有限公司；PH计：梅特勒–托利多仪器(上海)有限公司；高压灭菌锅：华粤企业集团有限公司–华粤行仪器有限公司；有机针式过滤器0.45 μm：上海安谱科学仪器有限公司；20~200 μL、10~1000 μL移液枪：德国Eppendorf公司。
2.2. 试验方法
2.2.1. 标准溶液配制
维生素B1、维生素B2标准储备液(1 mg/mL)：分别精确称取维生素B1、维生素b2标准品各0.01 g于10 mL棕色容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶液溶解后定容至10 mL。放置4℃冰箱避光保存，有效期2个月。
维生素B1、维生素B2标准工作溶液：吸取适合体积的标准中间工作液，采用梯度稀释的方式配制成标准工作溶液，浓度分别为：0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL，现配现用。
注：维生素B2标准溶液需校准。
2.2.2. 样品前处理
将9种野生菌分别分成2份，一份用破壁机搅碎后充分混合，密封保存并标记并于−20℃冰箱中保存；另外一份置于55℃烘箱中烘干，经粉粹机粉碎后充分混合，密封保存在避光室温下。
维生素B1：称取3 g样品于25 mL三角瓶中，加入15 mL 0.01 mol/L盐酸溶液，充分混匀，塞上软塞子，高于灭菌锅中121℃保证30 min，水解结束带冷却至40℃拿出，用2.0 mol/L乙酸钠溶液调pH值至4.0左右，加入2 mL混合酶，摇匀后置于37℃恒温振荡器上过夜，将酶解液全部转移25 mL比色管中，用水定容至刻度，6000 r/min离心5 min，取2 mL上清液于10 mL比色管中，加入1 mL亚铁氰化钾，涡旋混合均匀后加入2 mL正丁醇，再次涡旋混匀，6000 r/min离心5 min，取上清液经0.45 μm有机滤膜过滤上机测定。
维生素B2：称取3 g样品于25 mL三角瓶中，加入15 mL 0.01 mol/L盐酸溶液，充分混匀，塞上软塞子，高于灭菌锅中121℃保证30 min，水解结束带冷却至40℃拿出，用1.0 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至6.0~6.5，加入2mL混合酶，摇匀后置于37℃恒温振荡器上过夜，将酶解液全部转移25 mL比色管中，用水定容至刻度，6000 r/min离心5 min，取上清液经0.45 μm有机滤膜过滤上机测定。
2.2.3. 仪器条件
将9种野生菌分别分成2份，一份用破壁机搅碎后充分混合，密封保存并标记并于−20℃冰箱中保存；另外一份置于55℃烘箱中烘干，经粉粹机粉碎后充分混合，密封保存在避光室温下。
采用Spolar HPLC PACKED COLUMN 色谱柱(4.6 mm × 250 mm 5 μm)；柱温30℃；流速1 mL/min，进样量10 μL；流动相A：甲醇，B：0.05 mol/L乙酸钠；VB1等度洗脱程序：70%A：30%B；VB2洗脱程序：0~3 min，5%流动相B；3~5 min，5%~60%流动相B；5~10.0 min，60%流动相B；10.5~13 min，60%~5%流动相B；13~23 min，5%流动相B。线性方程、相关系数和波长见表1。
Table 1. Linear equation, correlation coefficient, and wavelength of vitamin B1 and B2
表1. 维生素B1、B2线性方程、相关系数和波长
3. 结果与分析
3.1. 9种野生菌中维生素B1、B2的含量
样品经过2.2.2节方法提取上机测定，测定结果为野生菌中均含有维生素B1、B2。谷熟菌中维生素B1 (0.114 mg/100g)和黄牛肝菌中维生素B2 (1.22 mg/100g)含量最高。检测结果见图1所示。
Figure 1. Content of Vitamin B1 and B2 in 9 wild mushrooms
图1. 9种野生菌中维生素B1、B2的含量
3.2. 烘干后野生菌中维生素B1、B2含量
将样品置于55℃烘箱中，烘干水分，将烘干后样品置于粉粹机中粉碎，充分混合后经2.2.2节方法提取上机测定，结果表明维生素B1、B2的含量远高于新鲜的野生菌，含量是新鲜野生菌的2~10倍。结果见图2所示。
Figure 2. Content of Vitamin B1 and B2 in wild mushrooms after drying
图2. 烘干后野生菌中维生素B1、B2含量
3.3. 9种野生菌中维生素B1、B2稳定性研究
在−20℃冰箱中存放，每隔7天经2.2.2节方法提取上机测定，发现VB1很容易降解，会随着存放时间变长含量会越来越低，到第四周检测时9种野生菌都降解完；但VB2明显得很稳定，不会因为时间短长短而降解，从第一周到第四周保持稳定状态。检测结果见表2所示。
Table 2. Study on the stability of vitamin B1 and B2 in wild mushrooms
表2. 野生菌中维生素B1、B2稳定性研究
3.4. 小结
本试验参照GB 5009.84-2016和GB 5009.85-2016对9种可食用野生菌中维生素B1和维生素B2含量分析，根据野生菌存放不同周期，发现维生素B1会随着存放周期增长而降解，但维生素B2却没有因为存放周期变化而有较大的影响；在55℃烘箱中烘干的野生菌中同样保留着维生素B1、B2，只是较维生素B2而言，维生素B1对热非常敏感，会随着时间温度升高而降解。因此，建议新鲜野生菌不要长时间存放于冰箱中，长时间存放会容易滋生微生物、部分营养成分分解，而烘干的野生菌水分含量少，微生物滋生的可能性降低，保存时间延长，且维生素B1、B2的含量远高于新鲜的野生菌。本文为食用菌营养价值评价、营养搭配、野生菌消费、野生菌存储加工等方面提供了理论依据，有助于对食用野生菌资源做出更全面和赚取的营养价值评价。
4. 讨论
为全力打造世界一流“绿色食品牌”，加快云南食用菌产业转型升级，2020年11月3日，云南省人民政府办公厅发布《云南省加快食用菌产业发展的指导意见》(云政办函〔2020〕97号)，明确目标要求推动与云南从食用菌资源大省向产业强省转变。到2022年云南全省野生食用菌综合产值达430亿元，成为继烟草之后云南第二大出口农产品，也成为一些地方农民现金收入的重要来源和贫困山区农民脱贫致富的重要途径。为保障野生菌资源的充分利用，一方面要加强野生菌中营养物质分析方法的标准体系建设；另一方面要加强野生菌营养价值综合评价体系的研究，有助于对野生菌资源做出更全面、更有价值的营养评价，为野生菌营养学的研究提供指导意义。
基金项目
国家市场监督管理总局技术保障专项项目(2022YJ25)。
NOTES
*通讯作者。