基于网络药理学及分子对接技术探讨黄芪甲苷治疗骨质疏松的作用机制研究

Mechanism of Astragaloside Intervention in Osteoporosis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Technology

摘要: 目的：采用网络药理学及分子对接方法探讨黄芪甲苷治疗骨质疏松的作用机制。方法：通过文献研究及Swiss数据库筛选得到黄芪甲苷活性成分并分析相关作用蛋白靶点，借助OMIM、GeneCards、DRUG BANK、DisGeNet等数据库分析骨质疏松基因靶点，并取交集；借助STRING数据库及Cytoscape软件构建PPI网络关系并得到黄芪甲苷干预骨质疏松关键靶点；借助metascape数据库进行生物富集分析；使用autodock软件进行核心化合物–蛋白分子对接。结果：得到黄芪甲苷涉及268个蛋白靶点，其中与骨质疏松相关核心靶点为ALB、IGF1、SRC、ESR1等；在分子对接实验中，Affinity平均值为−6.49 kcal·mol⁻¹，最小值为−13.46 kcal·mol⁻¹证明黄芪甲苷与核心蛋白有较大结合能；KEGG富集分析结果显示关键通路为AGE-RAGE signaling pathway、FoxO signaling pathway、PI3K-Akt sig-naling pathway等。结论：黄芪甲苷干预骨质疏松依靠多通路、多靶点协调作用，其主要通过ALB、IGF1、SRC、ESR1等蛋白作用与AGE-RAGE signaling pathway、FoxO signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等通路发挥治疗骨质疏松作用。

Abstract: Objective: To investigate the mechanism of astragaloside in the treatment of osteoporosis by network pharmacology and molecular docking. Methods: The active ingredients of astragaloside were obtained through literature review and Swiss database screening, and the related protein targets were analyzed. The osteoporosis gene targets were analyzed by OMIM, GeneCards, DRUG BANK, DisGeNet and other databases, and the intersection was selected. The PPI network relationship was constructed by using STRING database and Cytoscape software, and the key targets of astragaloside intervention in osteoporosis were obtained. Bioenrichment analysis was carried out with metascape database. Autodock software was used for core compound-protein molecular docking. Results: Astragaloside involved 268 protein targets, among which the core targets related to osteoporosis were ALB, IGF1, SRC, ESR1, etc. In the molecular docking experiment, the average value of Affinity was −6.49 kcal·mol⁻¹, and the minimum value was −13.46 kcal·mol⁻¹, indicating that astragaloside had greater binding energy with core protein. KEGG enrichment analysis showed that the key pathways were AGE-RAGE signaling pathway, FoxO signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, etc. Conclusion: The intervention of astragaloside in osteoporosis depends on multi-pathway and multi-target coordination. It mainly plays a role in the treatment of osteoporosis through the interaction of ALB, IGF1, SRC, ESR1 and other proteins with AGE-RAGE signaling pathway, FoxO signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway and other pathways.

1. 引言

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种以骨强度降低为特征的疾病，主要与骨组织丢失和骨微结构破坏有关 [1] 。OP患者的骨量减少、骨微结构损坏、骨脆性增加，极易发生骨折，严重影响患者的健康和生活质量 [2] 。随着医疗水平的发展，国内外对OP的研究不断深入，在OP的治疗组方中，黄芪作为基础药物存在，为治疗OP之要药 [3] 。黄芪(Astragali radix)为我国常用中药之一，黄芪甲苷(astraloside, AST)是黄芪的主要活性成分之一，现代研究表明其可通过调节FoxO3a信号通路，升高去势大鼠骨保护素及降钙素水平，提高骨密度，缓解去势大鼠的骨质疏松症状 [4] 且体外实验证实其可促进骨髓间干细胞分化，促进骨细胞活力。本文利用网络药理学研究方法，筛选黄芪甲苷干预骨质疏松的化学活性物质及作用靶点、机制，为后期该药物临床应用提供科学理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 黄芪甲苷化学成分及靶点筛选

借助chemdraw软件绘制化合物结构并导入Swiss TargetPrediction数据库及PharmMapper数据库得到结果去重即为该化合物核心作用靶点，并结合相关文献研究，最终获得黄芪甲苷核心基因靶点。

2.2. 骨质疏松相关靶点筛选

在GeneCards、DRUG BANK、OMIM等数据库获取骨质疏松核心基因靶点信息。在这些数据库中，DRUG BANK数据库主要以临床实验为依据，GeneCards、OMIM数据库更注重文献收集，因此选用多个数据库进行骨质疏松基因靶点获取有益于得到更加系统的靶点数据。

2.3. 黄芪甲苷成分–骨质疏松靶点

借助STRING分析平台，建立并分析PPI网络拓扑关系，借助CytoScape 3.7.2软件进一步优化结果，获得黄芪甲苷干预骨质疏松关键基因靶点信息。

2.4. GO功能富集及KEGG通路富集

借助Metascape平台进行核心基因靶点的生物信息数据富集分析，其中包括GO BP (生物过程)、GO MF (分子功能)、GO CC (细胞成分)及KEGG通路。将筛选结果构建富集条形分析图及通路气泡图。

2.5. 分子对接计算验证

通过对2.3.项结果分析得到该网络中度值排名最高的6个靶点蛋白，并结合RCSB平台下载该蛋白pdb格式，借助Openbabel软件将黄芪甲苷由sdf转化为pdb格式。借助pymol及Autodock软件对蛋白及化合物进行预处理及分子对接，以结合能(Affinity)作为判断二者结合活性的参考。

3. 结果

3.1. 黄芪甲苷主要化学成分基因靶点预测

通过文献研究并借助Swiss TargetPrediction及PharmMapper平台进行预测并去除所有重复基因后共计得到268个预测靶点。

3.2. 黄芪甲苷与骨质疏松相关基因靶点获取

利用Genecards平台共收集到骨质疏松相关靶点5260个，选取Score ≥ 0.98的结果结合TTD、DRUGBANK、OMIM数据库进行补充，共获得1449个核心疾病靶点。将黄芪甲苷核心靶点与骨质疏松核心靶点取交集，VENN分析得到78个核心作用靶点，见图1。

3.3. PPI网络构建

将“3.2.”项所得80个交集靶点导入String11.5平台做PPI网络分析，见图2。该网络共77个节点数，566条边，根据度值推测ALB、IGF1、SRC、ESR1等为核心靶点。

3.4. GO功能富集和KEGG通路富集

利用Metascape平台对交集基因进行生物信息富集分析，GO分析结果包括GO BP 982条，GO CC 41条，GO MF 95条；KEGG富集分析得到139条信号通路；取GO及KEGG分析结果排名前20建立生物信息富集分析图，见图3。

3.5. 黄芪甲苷分子对接筛选

将黄芪甲苷与ALB、IGF1、SRC、ESR1、MMP9、MAPK1 6个核心蛋白进行分子对接，从而得到6组化合物–蛋白对接结果。其中Affinity平均值为−6.49 kcal·mol⁻¹，最小值为−13.46 kcal·mol⁻¹证明黄芪甲苷与核心蛋白有较大结合能。本文对接结果为进一步进行黄芪甲苷相关实验提供理论支撑，对接结果见图4。

Figure 1. Drug-disease target VENN diagram

图1. 药物–疾病靶点VENN图

Figure 2. AST-OP target PPI network

图2. 黄芪甲苷–骨质疏松靶点PPI网络

(A) (B) (C) (D)

Figure 3. Enrichment analysis of potential targets of major components of AST (Note: (A) GO-BP analysis; (B) GO-CC analysis; (C) GO-MF analysis; (D) KEGG analysis)