基于网络药理学探讨辣椒改善心律失常作用机制

To Explore the Mechanism of Capsicum in Improving Arrhythmia Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：通过网络药理学和分子对接技术探讨辣椒改善心律失常作用机制。方法：检索文献查找辣椒的主要活性成分，利用pubchem和Swiss Target Prediction预测辣椒活性化合物的靶点基因；借助Gene Cards、OMIM数据库筛选心律失常靶点信息；利用Cytoscape 3.9.1软件构建药物–成分–靶点的可视化网络；通过STRING数据库对关键靶点构建蛋白相互作用(PPI)网络图；使用David数据库对共同靶点进行GO、KEGG通路富集分析；最后将活性成分与核心靶点进行分子对接，初步验证网络药理学结果。结果：检索文献选出常见的5种辣椒碱(辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高二氢辣椒碱和高辣椒碱)，15个辣椒素类物质治疗心律失常核心靶点(AKT1, HSP90AA1, ESR1, STAT3, ERBB2, PRKCA, HIF1A, MMP9, GRIN2B, RAC1, SLC6A4, CNR1, CHRNA7, TRPV1, NR3C2)。KEGG通路富集结果显示，辣椒素改善心律失常通路涉及神经活性配体–受体相互作用、钙信号通路、PI3K-Akt信号通路等。分子对接结果显示，辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高二氢辣椒碱和高辣椒碱均与核心靶点的结合性较好，推测这些成分可能为治疗心律失常的主要活性成分。辣椒碱可能通过作用于AKT1、HSP90AA1、ESR1、STAT3、ERBB2、PRKCA、HIF1A、MMP9、GRIN2B、RAC1、SLC6A4、CNR1、CHRNA7、TRPV1、NR3C2等关键靶点，调节神经活性配体–受体相互作用、钙信号通路、PI3K-Akt信号通路等3条信号通路来改善心律失常，初步揭示辣椒改善心律失常的潜在作用机制。

Abstract: Objective: To explore the mechanism of capsicum in improving arrhythmia through network phar-macology and molecular docking technology. Methods: By searching the literature to find the main active ingredients of capsicum, the target genes of active compounds in capsicum were predicted by pubchem and Swiss Target Prediction. Gene Cards and OMIM database were used to screen ar-rhythmia target information. Cytoscape 3.9.1 software was used to construct the visual network of drug-component-target. The protein interaction (PPI) network of key targets was constructed by STRING database. David database was used to perform GO and KEGG pathway enrichment analysis of the common targets. Finally, molecular docking of active ingredients with core targets was per-formed to preliminarily verify the network pharmacology results. Results: Five common capsai-cinoids (capsaicin, dihydrocapsaicin, nordihydrocapsaicin, homocapsaicin and homodihydrocapsai-cin) were selected by searching the literature. 15 core targets of capsaicin for arrhythmia (AKT1, HSP90AA1, ESR1, STAT3, ERBB2, PRKCA, HIF1A, MMP9, GRIN2B, RAC1, SLC6A4, CNR1, CHRNA7, TRPV1, NR3C2). KEGG pathway enrichment results showed that the improvement of arrhythmia by capsaicin involved neuroactive ligand-receptor interaction, calcium signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, etc. The results of molecular docking showed that capsaicin, dihydrocapsaicin, reduced dihydrocapsaicin, high dihydrocapsaicin and high capsaicin all had good binding to the core targets, suggesting that these components may be the main active ingredients for the treat-ment of arrhythmia. Capsaicin may act on key targets such as AKT1, HSP90AA1, ESR1, STAT3, ERBB2, PRKCA, HIF1A, MMP9, GRIN2B, RAC1, SLC6A4, CNR1, CHRNA7, TRPV1, NR3C2, etc. To im-prove arrhythmia by regulating neuroactive ligand-receptor interaction, calcium signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, and preliminarily reveal the potential mechanism of pepper in im-proving arrhythmia.

1. 引言

心律失常是一类危害人类身体健康的心血管疾病 [1] 。随着我国人口老龄化和国民生活方式的改变，心律失常发病率不断攀升，且呈现年轻化趋势 [2] 。心律失常患者的临床表现从无症状到心脏骤停，占心源性猝死患者的50%~60% [3] 。2022年7月发布的《中国心血管健康与疾病报告2021概要》显示，我国居民心血管病死亡仍居首位 [4] 。这凸显出心律失常风险预测、预防和治疗等临床需求尚未得到满足。因此，不断加强心血管疾病预防体系建设，提升心血管疾病治疗水平显得尤为重要。心律失常是心脏激动的频率、节律、起搏部位、传导速度或激动次序等出现异常的临床综合征，以心动过缓或过速伴或不伴心动不规律为主要特点 [5] 。临床根据心动频率常将其分为快速性(型)心律失常和缓慢性(型)心律失常两大类。中医常将其归属于“心悸”、“怔忡”、“厥证”等范畴。《黄帝内经》中也有“心下鼓”、“心怵惕”、“心中憺憺大动”和脉相的“参伍不调”等相关记载。目前，现代医学在治疗心律失常方面已取得巨大成就 [6] ，但其不良反应也日益显现。近年来，中医药因其整体调治、毒副作用小、疗效显著等优势，在心律失常治疗中显示出广阔的发展前景。

辣椒(Capsicum annum L.)为茄科草本植物或其变种的干燥果实 [7] 。辣椒原产地是美洲，明朝时期传入我国，是成为我国种植量最多的蔬菜之一。辣椒富含多种营养成分，如辣椒素类、维生素A、维生素C、类胡萝卜素、酚类等化合物及多种微量元素 [8] 。Thresh于1876年首次分离出结晶形式的化合物，并将其命名为“辣椒碱类” [9] 。辣椒素类物质为辣椒属植物所特有的一类生物碱化合物，是7个同源的支链烷基香草酰胺的混合物。物质包括5种：辣椒碱(CAP)、二氢辣椒碱(DHCAP)、降二氢辣椒碱、高二氢辣椒碱和高辣椒碱 [8] [10] 。辣椒碱和二氢辣椒碱含量最丰富，占总辣椒碱的近90%，二者的差别在于支链脂肪酸的碳9处的不饱和双键 [11] 。活性最高的辣椒素是二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱和高辣椒碱 [12] 。据现代研究论证辣椒素类物质具有保护心脑血管、降脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等诸多作用 [13] 。有研究表明，心血管系统中对辣椒素敏感的TRPV 1通道被激活，可释放各种神经肽，在生理调节以及心律失常、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的病理生理中发挥着重要作用 [14] 。同时，另一项研究表明，辣椒素效应并不总是与TRPV 1受体激活相关 [15] 。

本研究旨在利用网络药理学和前人实验研究相结合的方式，反应辣椒多成分、多靶点作用关系，阐明辣椒改善心律失常的潜在调控机制，为辣椒研究提供一种新的思路和依据。

2. 研究方法

2.1. 药物活性成分及作用靶点的预测

通过检索相关文献收集辣椒主要活性成分，并以检索的活性成分为关键词，依次输入到pubchem数据库中获得相对应的2D结构式和标准的SMILES编码(simplified molecular input entry specification)。随后使用Swisstarget Prediction数据库，限定物种为“Homo sapiens”，利用SMILES结构式和2D结构式对药物化合物进行靶点预测，取Probability ≥ 0的靶点，合并之后去除重复值，获得有效成分作用靶点，下载保存为CSV格式，利用Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)进行标准化处理，将靶蛋白名转化成规范化的基因靶点简称。

2.2. 心律失常靶点的预测

以“cardiac arrhythmia、arrhythmia”为关键词，利用Genecard数据库(http://www.genecards.org/)和OMIM数据库(https://www.omim.org/)进行检索，筛选出与心律失常相关的疾病靶点，在Uniprot数据库标准化后去除重复的靶点，即为疾病靶点的数据集。

2.3. 关键靶点的筛选

利用Venny 2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，导入“2.1.”和“2.2.”项获得的靶点绘制韦恩图；得到的交集靶点即为辣椒治疗心律失常的关键靶点。

2.4. “中药–成分–疾病–靶点”网络构建

将中药、活性成分、所治疾病与关键靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，各节点(Node)表示成分和靶点，边(Edge)表示节点相互作用关系，使用Merge功能构建网络。

2.5. 蛋白相互作用网络构建

将共同靶标蛋白导入STRING 11.0数据库，选择“multiple proteins”选项，物种设置为“Homo sapiens”，其余参数保持默认，获取蛋白相互作用(Protein-protein interaction，PPI)的关系，导出为csv格式文件，并导入Cytoscape 3.9.1软件形成可视化网络；通过自带插件Network Analyzer对网络拓扑参数节点度(Degree)、介数中心性(Betweenness Centrality)、平均最短路径长度(Average shortest path length)和接近中心性(Closeness Centrality)进行分析。并基于Betweenness值进行排序。1.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析。

以标准基因名的形式将活性成分的关键靶标基因列表导入DAVID数据库 (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，设置标识符为“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”，限定物种为“Homo sapiens”，设定阈值P < 0.05，对作用靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。为进一步探讨交集靶点可能涉及的信号通路、生物进程(Biological Process, BP)、细胞组分(Cellular Component, CC)、分子功能(Molecular Function, MF)等信息，整理数据后导入微生信(https://www.bioinformatics.com.cn)可视化处理。

3. 结果

3.1. 活性成分及靶点

根据文献检索得到5个主要活性成分，见表1。通过Swiss Target Prediction数据库中找出化学成分对应的靶基因名称，物种限定为“Homo Sapiens”，去除重复的基因，获得114个靶点。

Table 1. Actice ingredients of Capsicum

表1 辣椒碱基本信息

3.2. 潜在作用靶点预测

Figure 1. Capsicum-Cardiac arrhythmia common targets (Venn)

图1. 辣椒–心律失常交集基因靶点Venn图

检索Gene Cards和OMIM数据库，其中Gene Cards数据库设置Score值 ≥ 0。两个数据库的筛选结果删除重复基因后得到心律失常靶点4803个。并通过VENNY 2.1软件取共同靶点绘制韦恩图，得到辣椒碱治疗心律失常相关靶点116个，如图1。

3.3. PPI网络构建与聚类分析

将116个共同靶点上传至STRING 11.0数据库进行分析，构建辣椒碱与心律失常的靶点PPI网络图。该网络中发生蛋白相互作用的靶点有114个(其中2个靶点未发生蛋白相互作用，故剔除)，包括116个节点，739条边，平均节点度值为12.7，见图2。运用Cytoscape 3.9.1软件对114个靶点进行拓扑分析，其中Betweenness值越大则节点越大，表示辣椒碱通过此靶点治疗心律失常的可能性越大。根据分析结果取Betweenness值排名前15的靶点，依次为AKT1、HSP90AA1、ESR1、STAT3、ERBB2、PRKCA、HIF1A、MMP9、GRIN2B、RAC1、SLC6A4、CNR1、CHRNA7、TRPV1、NR3C2推测这些靶点可能是改善心律失常的核心靶点，见图3。

Figure 2. PPI network construction and core target screening process diagram

图2. PPI网络构建及核心靶点的筛选过程图

Figure 3. PPI core target map (the darker the color and the larger the circle, the larger the value)

图3. PPI核心靶点图(颜色越深、圆越大表示值越大)

3.4. “中药–成分–疾病–靶点”网络构建

Figure 4. Construction of “TCM-component-disease-target” network

图4. “中药–成分–疾病–靶点”网络构建

运用Cytoscape 3.9.1软件构建辣椒碱活性成分作用靶点–信号通路网络(图4)。图中包括辣椒碱成分5个；辣椒碱与心律失常共同靶点114个；信号通路10条。筛选出的辣椒活性成分的作用靶点。

3.5. GO功能富集分析

GO富集分析结果显示(图5)，辣椒碱参与的生物过程(biological process, BP)包括：蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)、G蛋白偶联受体信号通路，偶联环核苷酸第二信使(G-protein coupled receptor signaling pathway, coupled to cyclic nucleotide second messenger)、G蛋白偶联血清素体信号通路(G-protein coupled serotonin receptor signaling pathway)、MAP激酶活性的正向调控(positive regulation of MAP kinase activity)、化学突触传递(chemical synaptic transmission)、细胞增殖的正向调节(positive regulation of cell proliferation)、MAPK级联的正向调控(positive regulation of MAPK cascade)、信号转导(signal transduction)、肽基酪氨酸磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation)、对缺氧的反应(response to hypoxia)。参与细胞生成 (cellular component, CC)主要包括：等离子体膜(plasma membrane)质膜的组成部分(integral component of plasma membrane)、树突(dendrite)、突触后膜(postsynaptic membrane)、突触(synapse)、突触前膜的组成部分(integral component of presynaptic membrane)、谷氨酸能突触(glutamatergic synapse)、突触前膜(presynaptic membrane)、神经元细胞体(neuronal cell body)、突触后膜的组成部分(ntegral component of postsynaptic membrane)等。分子功能(molecular function，MF)主要富集于：G蛋白偶联血清素受体活性 (G-protein coupled serotonin receptor activity)、酶结合(enzyme binding)、神经递质受体活性(neurotransmitter receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、ATP绑定(ATP binding)、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性 (protein serine/threonine kinase activity)、相同的蛋白质结合(identical protein binding)、激酶活性 (kinase activity)、蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性(transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity)等。

图中，横坐标是富集倍数(Fold Enrichment)，纵坐标是GO名称，圆圈大小代表着富集在GO通路上基因的数目，圆圈颜色则代表富集的显著性，颜色越红，则代表基因在GO上富集的越显著。

Figure 5. GO analysis of Capsicum therapy for arrhythmia

图5. 辣椒治疗心律失常GO分析

3.6. KEGG通路富集分析

KEGG通路富集显示(见图6)，辣椒碱改善心律失常的靶点主要集中在前列腺癌(Prostate cancer)、癌症通路(Pathways in cancer)、神经活性配体–受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、癌症中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、内分泌的阻力(Endocrine resistance)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)、癌症中的中枢碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)、非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。

图中，横坐标是富集倍数(Fold Enrichment)，纵坐标是通路名称，圆圈大小代表着富集在kegg通路上基因的数目，圆圈颜色则代表富集的显著性，颜色越红，则代表基因在KEGG上富集的越显著。

Figure 6. Analysis of KEGG pathway in treatment of arrhythmia with Capsicum

图6. 辣椒治疗心律失常KEGG通路分析

4. 讨论

心律失常是指心脏正常活动或跳动过程中的异常或扰动。窦房结向心房发出去极化波，去极化房室结通过希氏–浦肯野系统传播，并以系统性方式使心室去极化。心律失常包括有病态窦房结综合征、窦性心动过速、心房颤动等。心律失常的严重程度取决于有无器质性心脏病。并发有冠心病或严重左心室功能障碍可能导致心力衰竭或心脏性猝死。其常见临床症状有头晕、心悸、心跳加快等。

通过检索相关文献，辣椒相关活性成分有5个，将辣椒活性成分与心律失常靶点进行交集，共同作用的靶点基因去重后共有114个，提示了辣椒治疗心律失常潜在的作用。对共同靶点进一步的拓扑分析，取Betweenness值排名前15的靶点，依次为AKT1、HSP90AA1、ESR1、STAT3、ERBB2、PRKCA、HIF1A、MMP9、GRIN2B、RAC1、SLC6A4、CNR1、CHRNA7、TRPV1、NR3C2，推测这些靶点可能是改善心律失常的核心靶点。同时KEGG富集分析结果表明，神经活性配体–受体相互作用、钙信号通路、PI3K-Akt信号通路等可能是辣椒治疗心律失常的关键通路。辣椒素激活TRPV1后，诱导开放细胞钙离子通道，钙离子回流，导致细胞内钙离子浓度升高，进而改善心律失常 [16] 。对TRPV1活性和特性的全面研究表明，它是一个非选择性的阳离子通道，表现出对钙离子的优先性 [17] 。一项研究表明 [18] ，TRPV1在心血管系统中活化后介导机体释放的降钙素基因相关肽和P物质发挥协同保护心肌的效应。降钙素基因相关肽可以促进心肌氧自由基的清除，增加机体抵抗缺氧环境的能力，从而对心肌起到保护作用，P物质可能通过增加NO的释放量来拮抗去甲肾上腺素诱导的肌浆网Ca²⁺-ATP酶活性的改变，心肌细胞内Ca²⁺维持稳定，从而实现对心脏室性心律失常的调节 [19] [20] 。另外，在KEGG通路富集分析中，AKT相关度最高，而AKT1是P13K-AKT信号通路的关键下游靶点。

综上，通过检索相关文献，在网络药理学的指导下，获得辣椒所具有活性成分、核心靶点以及信号通路。结合PPI网络分析以及KEGG通路富集分析结果，辣椒可能通过神经活性配体–受体相互作用、钙信号通路、PI3K-Akt信号通路发挥抗心律失常的作用。本研究为今后实验论证提供依据。

NOTES

^*通讯作者。