实时荧光定量及数字PCR技术在病毒检测中的应用及研究进展

Application and Research Progress of Re-al-Time Fluorescence Quantitative PCR and Digital PCR Techniques in Virus Detection

摘要: 实时荧光定量PCR是在传统PCR技术基础上发展而来的一种通过收集荧光信号来进一步检测目的基因扩增数量的定量PCR技术，较传统PCR技术有着灵敏度高，特异性高和准确度高等优点，广泛应用于病毒的快速分型，相似病毒的鉴别诊断等。同时随着微流控技术的逐渐发展，数字PCR技术以其绝对定量及更高的灵敏度准确度等优势，在病毒DNA定量检测、基因突变检测等领域得到广泛应用。本文将对两种PCR技术的原理、分类、各自在病毒检测领域中的前沿应用及优势对比进行了详细综述。

Abstract: Real-time fluorescence PCR is a quantitative PCR technique developed on the basis of traditional PCR technology, which collects fluorescent signals to further detect the number of target genes am-plified. It has the advantages of high sensitivity, high specificity and high accuracy compared to tra-ditional PCR techniques, and is widely used for rapid typing of viruses and differential diagnosis of similar viruses. Meanwhile, with the gradual development of microfluidic technology, digital PCR techniques have been widely used in the fields of viral DNA quantification and gene mutation de-tection with its advantages of absolute quantification and higher sensitivity and accuracy. In this paper, a detailed review of the principles and classification of the two PCR techniques, their respec-tive cutting-edge applications in the field of virus detection and comparison of their advantages are presented.

1. 引言

病毒性流行病在世界范围内迅速传播，在短时间内造成高死亡率。我们迫切需要开发一种快速、敏感、经济、高效的病毒检测方法。常规病毒诊断方法主要有：病毒分离培养、抗原抗体检测、电子显微镜检测、组织病理切片检查、核酸检测等。近年来，在传统PCR技术基础上发展而来的实时荧光定量PCR及基于微流控技术发展而来的数字PCR因其具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点被广泛应用于病毒核酸检测。此外，新型数字PCR灵敏度更高且可以实现病毒核酸检测的绝对定量，更加适用于罕见基因突变检查及低载量病毒核酸检测 [1] 。因此本文将对两种PCR技术的原理、分类、各自在病毒检测领域中的前沿应用及优势对比进行综述。

2. 实时荧光定量PCR

2.1. 实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR修饰语：实时、荧光、定量。即在传统PCR体系中加入荧光物质，在PCR扩增过程中，它可以与每一次循环后的产物结合，我们通过收集其发出的荧光信号生成特定的扩增曲线来检测是否有目的基因及推测目的基因的起始拷贝数。

我们以探针法为例解释荧光信号的发出及收集过程：将加入荧光标记的探针与模板DNA混合后，高温变性解螺旋，低温复性再配对，探针与模板DNA配对的同时被切断，释放荧光素，在紫外线的激发下发出荧光，收集每一次DNA复制时的荧光信号进一步形成扩增曲线；一般而言，荧光扩增曲线可分为4个时期，即基线期、指数增长期、线性增长期与平台期 [2] 。最适合分析荧光信号的时期为指数增长期，基线期荧光信号太低，无法分析模板起始拷贝数。线性增长期虽然正在复制，但非指数式增长，相比指数增长期，分析难度更大。平台期同一模板不同条件下的梯度曲线，相对来说更为混乱，不利于分析数据。相反，在指数增长期，曲线重复率更高且产物对数值与初始模板量存在线性关系，因此，分析数据更为准确可靠。数据分析需要了解两个重要概念：1) 荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3~15个循环荧光信号标准偏差的10倍 [3] 。2) CT值(Cycle threshold，循环阈值)：指荧光信号超过阈值时对应的循环数 [4] 。从某种程度上来说，阈值的设定决定了CT值，而CT值可以反映目的基因起始拷贝数的大小，两者成负相关 [5] 。

2.2. 实时荧光定量PCR的分类

2.2.1. 实时荧光定量PCR定量方法分类

实时荧光定量PCR定量方法可以分为绝对定量法和相对定量法。绝对定量主要用于微生物学量化其拷贝数、食品和生物技术量化商品、掺杂物数量等领域，而相对定量主要用于基因组学和转录组学，以及在生物实验中进行基因表达分析等 [6] 。绝对定量法需要将标准品梯度稀释，待测样本初始拷贝数主要通过将样本CT值代入标准曲线来获取，标准曲线横坐标为标准品核酸浓度，纵坐标为标准品相应的CT值，通过线性关系代入获得样本起始拷贝数。相对定量法主要原理为将靶基因Ct值与对照组的Ct值进行对比，结果用靶基因量与对照组靶基因量的比值或差异倍数来表示。现在主要方法有2^−∆∆CT法 [7] [8] ，双标准曲线法 [9] 等。杨振苹等人 [9] 建立了一种利用Taq Man探针，绘制双标准曲线，检测重组CHO细胞中外源基因起始模板量的方法，可用于高重组CHO细胞株的筛选和细胞库传代稳定性的检测。

2.2.2. 实时荧光定量PCR检测方法分类

实时荧光定量PCR检测方法现在主要有染料法、探针法、分子信标法、核酸类似物法等，其中前三种应用更为广泛。常用的DNA染料主要有Hoechst 33258、SYBR Green I、溴化乙锭、SYBR Gold、PicoGreen等。SYBR Green因其经济、简便，被广泛应用，其作用原理为SYBR Green染料会与每一个新产生的双链DNA分子进行结合，荧光强度也会随着PCR产物的增加而增加。SYBR Green染料法的最大缺点在于可能会产生假阳性信号；因为SYBR Green染料可与任何的双链DNA发生结合，因此也会与非特异性的双链DNA序列发生结合，因此应注意做熔融曲线增强其特异性。现在陆续研制出新型染料例如EvaGreen染料 [10] 等，其稳定性，特异性相比SYBR Green更强。探针法中目前常用TaqMan，该探针两端分别为淬灭集团和荧光集团的寡核苷酸，正常情况下两个集团互相抵消，发出的荧光被淬灭，当DNA在引物引导下复制时，探针被酶切降解导致荧光集团和淬灭集团分离，荧光信号被释放。分子信标法是TaqMan探针的衍生产物，是一种类似发卡结构的茎环寡核苷酸，中间的环序列与目标核酸序列互补，荧光集团和淬灭集团分别连在茎的两端，发光原理类似于TaqMan探针。Harsheni等人 [11] 发现添加PCR增强剂可以增强PCR的性能。每种PCR添加剂都具有独特的性质，因此启发我们选择合适PCR增强剂及更为匹配的PCR检测方法也许更有利于PCR扩增及目的基因的检测。

3. 数字PCR的原理及分类

早在1992年，Sykes [12] 等人就报道过一种无限稀释模板PCR，依靠泊松数据统计来更加准确定量样本初始拷贝数的方法，后不断发展创新。数字PCR主要原理是：极限稀释模板(当然模板浓度不能过高)分成很多个小的反应单位，每个反应单位都有一个特殊的封装区域，以防止反应器之间的交叉污染。每个反应单位独立进行PCR反应，有荧光信号的反应单位标记为1，无荧光信号的反应单位标为0，然后收集统计数据 [1] [13] 。在极限稀释的过程中，不可能每个反应单位恰好为1个DNA分子，也有可能为0或是多个，但是它们的分布符合泊松分布，根据泊松公式 [14] 即可算出。数字PCR目前的分类主要有基于微反应腔室的数字PCR系统、基于集成化微流控芯片的数字PCR系统以及基于液滴的数字PCR系统等 [1] ，随着微流控技术的发展，基于液滴的数字PCR系统在提高诊断测试性能方面取得了显著进展，与传统方法相比，液滴的生产更方便，更快速，更精确，成本更低，使得基于液滴的微流体数字PCR在过去的几年迅速发展 [15] 。

4. 普通PCR与实时荧光定量PCR与数字PCR特点对比

普通PCR、实时荧光定量PCR和数字PCR是分子生物学中常用的三种PCR技术，它们在核酸扩增及检测方面存在一些不同之处。三种PCR技术各自优势对比及主要应用见表1 [13] [16] [17] 。

Table 1. Comparison of normal PCR, real-time fluorescence quantitative PCR and digital PCR

表1. 普通PCR、实时荧光定量PCR与数字PCR的对比

5. 实时荧光定量PCR及数字PCR在病毒检测中的实际应用和对比

5.1. 新型冠状病毒

2019年12月，我国武汉爆发新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，原因为感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)所致 [18] ，早期感染新型冠状病毒患者会出现急性呼吸窘迫综合征、心脏损害等严重并发症，严重者可致死亡 [19] [20] [21] 。因此早期和快速诊断在疾病诊治和预防过程中起了重要作用，其中实时荧光定量PCR和数字PCR在新冠病毒的检测中起了关键作用。实时荧光定量PCR因为其技术成熟，商品化试剂种类多，灵敏度高，经济便捷等被认为是新冠病毒检测的“金标准” [22] ，但是实时荧光定量PCR同样也暴露出了许多问题，比如：取样不同而导致病毒检测结果差异、试剂盒不同导致病毒检测结果不同 [23] ：例如陈炜等 [24] 通过使用荧光定量PCR对4例新冠患者的咽拭子和痰液标本中的基因ORF 1ab及N基因进行分别检测，发现咽拭子的基因荧光信号低于痰液标本。Dong等 [25] 曾对75名密切接触者及16例康复者患者做了实时荧光定量PCR及数字PCR检测比较，发现对于密切接触者，其疑似率由21%显著下降到1%，因此数字PCR更适合密切接触者和康复者及无症状感染者这种低载量病毒的检测，同时也可以应用于一些低痕病毒的检测，比如海关物品表面病毒检测等 [26] 。Hao Yin等人 [27] 率先提出了将液滴数字和快速PCR技术结合起来的快速ddRT-PCR方法，能够更为高效、准确、定量地检测SARS-CoV-2 RNA。此方法通过使用ORF1ab，N基因和RNase P基因，优化参考RNA样品的快速ddPCR的操作参数。对优化系统的性能进行基准测试后发现诊断的准确性与商业检测试剂盒一致。尽管世界卫生组织5月5日已经宣布新冠病毒感染疫情不再构成“国际关注的突发公共卫生事件”，但病毒仍在不断变异，无需RNA提取和扩增即可快速、高通量SARS-CoV-2 RNA检测仍然是一项关键挑战，Chu Y等人 [28] 开发了一种利用微流控生物芯片快速、超灵敏地检测SARS-CoV-2的方法，该方法通过使用多个DNA探针对不同浓度SARS-CoV-2 RNA (10⁻¹⁷, 10⁻¹⁸, 10⁻¹⁹, 10⁻²⁰ M; 50 ul)进行检测，发现最低浓度为10⁻²⁰ M，大大提高了微流控生物芯片的检测灵敏度，并且能够满足高通量筛选、低成本、易操作的要求，有效检测和阻断COVID-19的传播。

5.2. 肝炎病毒

在全球超过350万人成为乙肝病毒携带者，约20多万人感染乙肝病毒 [29] ，在我国这个“乙肝大国”的大背景下，准确检测及治疗乙肝显得尤为重要，实时荧光定量PCR和数字PCR技术都可以应用于对乙肝的确诊，分型，以及耐药突变体等检测 [30] 。其中实时荧光定量PCR更适合于乙肝的确诊，分型等。数字PCR因其更高的准确性，灵敏度，相比于荧光定量PCR，最低检测限度更低，在慢性肝炎患者中发挥着更重要的作用。丙型肝炎病毒的共价闭合环状DNA (cccDNA)已成为隐匿性乙型肝炎病毒感染和肝细胞癌的一种新的预后生物标志物 [31] [32] 。Gian等人 [33] 发现在肝内HBV cccDNA检测方面，ddPCR比qPCR的灵敏度高10~100倍，所需拷贝数更低，尽管如此，Yong-Jun Han等人 [34] 通过优化双链探针的长度、互补寡核苷酸之间的杂交自由能和粘端长度，成功利用荧光定量PCR检测到了5 IU/mL的HBV DNA，这表明荧光定量PCR对于低拷贝数DNA检测仍有一定的潜在价值。

5.3. 流感病毒

流感病毒可以引起全球急性呼吸道感染，每年可导致全球300万-500万流感相关住院病例及25万~30万死亡病例 [35] [36] ，其中包括近38万1岁以下婴幼儿和87万5岁以下儿童的住院病例 [37] 。目前数字PCR检测流感病毒的文献相对于实时荧光定量较少，实时荧光定量在检测流感病毒领域比较成熟，主要用于流感病毒、禽流感病毒的诊断与分型等 [38] [39] [40] 。近年来，新型双重及多重RT-PCR被广泛应用于快速检测SARS-CoV-2、甲型/乙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒等 [41] [42] 。数字PCR更适用于流感病毒的绝对定量、低浓度流感样本的检测，针对流感样本或核酸存在降解的流感样本扩增 [43] 。Yong Yan等人 [44] 通过使用逆转录液滴数字PCR (RT-ddPCR)来动态监测人类H7N9感染的病毒载量，同步进行实时RT-PCR技术对比，实验结果表明，与实时RT-PCR相比，RT-ddPCR在不使用标准曲线的情况下量化H7N9病毒载量方面更加灵敏和准确。存在天然奥司他韦耐药的季节性H3N2流感病毒株，通常在神经氨酸酶的119位基因上发生谷氨酸到缬氨酸的替换(E119V-NA)，早期检测抗奥司他韦性流感病毒对病人管理和快速遏制抗病毒性非常重要，Laura A E Van Poelvoorde等人 [45] 开发了一种逆转录酶数字PCR测定(RT-ddPCR)的方法来检测和量化E119V-NA突变的频率。其对耐药流感病毒的检测和量化提供了一种新的技术路线。

5.4. EB病毒

1964年，在伯基特淋巴瘤的活组织检查中发现并分离出EB病毒(epstein-barrvirus, EBV) [46] 。EB病毒与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌等疾病密切相关，目前EB病毒的检测技术主要有EBV 细胞培养检测、EBV血清学检测、EBV抗原抗体亲和力检测、EBV 原位杂交检测、EBV嗜异性抗体检测、EBV特异性抗体检测、EBV核酸载量检测等 [47] 。其中核酸检测是目前诊断EB病毒导致疾病的最常用的方法 [48] 。荧光定量PCR检测EBV-DNA已广泛运用于EBV相关疾病的诊断、治疗方案的选择、疗效判定、病情检测及预后判定等 [49] 。林卫虹等人 [50] 收集229例疑似EB病毒感染患者的血液标本，对同一份血浆标本的EB病毒同时采用数字PCR和荧光定量PCR两种方法测定其DNA载量，结果显示采用qPCR方法有58.26% (67/115) EBV阳性患者被漏诊，表明对于低载量的EB病毒检测，ddPCR检测灵敏度高于qPCR。这与王心仪等人检测西南地区510例EB病毒载量的结果一致 [51] 。同样，M. C. Siciliano等人 [52] 通过使用ddPCR方法检测一大型EBV阴性B细胞淋巴瘤队列中发现，几个传统上被归类为EBV阴性的罕见肿瘤细胞中存在EBV DNA。并推测这种“EB病毒逃逸机制”可能与Timp2和Eya1基因的甲基化有关。

6. 结语与展望

实时荧光定量PCR以其灵敏度高、特异性强、经济便捷以及成熟商品化试剂盒等优势在病毒的早期检测、病毒分型、病毒鉴别等领域被广泛应用。同时数字PCR因其更高灵敏度及特异度、可以实现绝对定量来检测微小浓度差异等新型优势可以弥补甚至代替荧光定量PCR技术。但因其成本过高，目前国内成熟商品化试剂盒较少，作为一门新型技术，在国内尚有许多不足需要改进，随着科学技术的不断进步，我们可以预测更多基于数字PCR的系统将被开发和商业化。同时随着新冠病毒的大流行，为快速进行临床诊断，PCR试剂盒的小型化以及便携式PCR系统的开发将进一步发展。

基金项目

1) 山东省自然科学基金资助项目(ZR2018PH009)；2) 济宁医学院附属医院博士科研启动基金(2017-BS-15)。

NOTES

^*通讯作者。