1. 引言
鲢(Hypophthalmichthys molitrix)广泛分布于我国长江、珠江、黑龙江流域，是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一 [1] 。其具有营养丰富、食物链短、成活率高、养殖成本低，兼具低碳、水生生物资源养护、修复水域生态环境等优良特性；且对国内大宗水产品的稳定有效供给、食品安全及大食物观发展理念的贯彻，人们膳食结构改善方面起着至关重要的作用。据统计，2021年全国鲢养殖产量达383.66万吨，居我国淡水鱼类养殖产量的第二位，仅次于草鱼(575.51万吨) [2] ，可见鲢养殖在促进渔民增收、渔业增效及产业高质量发展方面成效显著。长丰鲢(Changfeng silver carp)为中国水产科学研究院长江水产研究所选育的我国“四大家鱼”的第一个水产新品种；与鲢相比，具有生长快、体型好、出肉率高、耐低氧、遗传稳定等优良性状 [3] ，自2010年通过全国水产原种和良种审定委员会审定以来，已推广至全国27个省市、自治区可控的淡水水域进行增、养殖，产生显著的经济、社会与生态效益。此外，长丰鲢性情较鲢稍显温和，但受刺激亦易跳跃，在运输过程中往往造成鲢不同程度的损伤影响其成活率。为了减少鱼的应激反应，提高鲢运输途中的成活率，运输前对其进行麻醉是较好的策略。
鱼用麻醉剂有很多，包括MS-222 (间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)、丁香酚、CO2、喹哪啶、美托味酯等，其中MS-222应用较为普遍。MS-222 (分子式C10H15NO5S)其为白色结晶或粉末，易溶于水，水溶液透明无色，呈微酸性、耐高温。国际商品名称为Fingudi、Matacaine、Tricaine，麻醉时具有浓度低，诱导鱼体入麻时间快且复苏时间短，无毒副作用等优点，是当前世界各国广泛应用于水生动物中安全、有效的麻醉药物。在美国，经美国食品和药物管理局(FDA)认可，MS-222为唯一可用于食用鱼的麻醉剂 [4] ，已经广泛用于鱼类的活体运输、标志放流。MS-222的大量使用可能导致其在水产品中产生残留，给水产品的食用安全性带来潜在的风险。为了保证水产品的食用安全性，国际上对MS-222在水产品中的使用进行了严格规定。如美国FDA规定经MS-222麻醉的食用鱼必须经21 d休药期才可在市场上销售，加拿大规定的休药期为5 d [5] [6] 。有关MS-222的检测方法主要有比色法 [7] 、气相色谱法、液相色谱法 [8] 、液相色谱串联质谱法、高效液相色谱–串联质谱法等 [9] 。国内，目前利用MS-222对水生动物进行麻醉的研究及生理生化影响已有相关报道，如半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、中华鲟(Acipenser sinensis)、施氏鲟(Acipenser schrenckii)、美洲鲥(Alosa sapidissima)、刀鲚(Coilia nasus Schlegel)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、四川华吸鳅(Sinogastromyzon szechuanensis)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫(Carassius auratus)、翘嘴鲌(Culter alburnus)、鲢、鳜(Siniperca chuatsi)、花鲈(Lateolabrax maculatus)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、珍珠龙胆石斑鱼(E. fuscoguttatus (♀) x E. lanceolatus (♂))、长蛸(Octopus minor)等 [10] - [26] 。而鲜有研究鲢在MS-222麻醉下其效果及组织内酶活性的变化。本研究以鲢新品种为研究对象，通过比较MS-222在不同麻醉浓度、不同施麻时间条件下对鲢麻醉效果与组织内酶活指标的影响。参考杜浩等的研究方法 [12] ，将50~130 mg/L浓度定义为高浓度，将10~30 mg/L浓度定义为低浓度，对鲢在高浓度下的生理指标的变化和在低浓度下麻醉剂溶液对肝脏、脾脏、鳃的抗氧化酶活性进行研究，探究高浓度条件下急性麻醉，低浓度条件下长效麻醉的最合适浓度，为在鲢和长丰鲢的运输中得到应用提供参考。
2. 试验材料与方法
2.1. 试验材料
2.1.1. 试验鱼
试验鲢采自中国水产科学研究院长江水产研究所梁子湖试验场，其规格体重为(105 ± 5.0) g，体长为(18 ± 2.0) cm，暂养试验场养鱼车间塑料桶(容积为200 L)中1周，每个桶放20尾，气泵持续通气以维持氧浓度，水温为(17.8 ± 0.5)℃，溶氧量保持在(7.77 ± 0.30) mg/L。在试验中，选择健康、无伤、规格整齐的鲢进行试验。试验用水来自曝气后的自来水。
2.1.2. 试验试剂
本试验使用的试剂MS-222麻醉剂购买自于上海希格玛高技术有限公司，CAT试剂盒，ACP试剂盒，AKP试剂盒购自南京建成生物工程研究所；蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司合成。
2.2. 麻醉方法
试验鱼使用MS-222麻醉时使用一定量的碳酸氢钠调节实验容器水体的pH值，控制在7.0~7.5范围。
2.2.1. 高浓度麻醉方法
试验时，在塑料桶注入30L经曝气的自来水，分别加入1.5、2.1、2.7、3.3、3.9 g的MS-222粉末，充分搅拌使其溶解，配置成浓度为50、70、90、110、130 mg/L的麻醉剂溶剂，并设对照组。每个浓度设置三组重复。每个塑料桶中投放鲢5尾，同时计时观察。
2.2.2. 低浓度麻醉方法
试验时，在塑料桶注入曝气的自来水200 L，并分别在塑料桶中加入2.0、4.0、6.0 g的MS-222粉末，充分搅拌使其溶解，配置成浓度为10、20、30 mg/L的麻醉剂溶剂，同时设空白对照组。每个浓度设置三组重复。每个塑料桶中放入鲢20尾，同时开始计时观察。放鱼后分别在1、3、6、12、24 h时间点每个塑料桶中各取出5尾鲢进行解剖，采集肝、脾、鳃组织后立即放入液氮中保存备用。
2.3. 样品处理方法
取低浓度MS-222麻醉处理1、3、6、12、24 h的组织样品解冻。将其肝脏、脾脏、鳃组织分别称取0.1 g以组织样：生理盐水 = 1 g:10 ml混合。混合后在高速组织研磨仪中60 HZ低温研磨30 s。匀浆后将匀浆液置高速冷冻离心机4℃，2500 r/min，离心10 min。取上清液即为10%的组织匀浆，测定不同MS-222麻醉处理时间的鲢肝脏、脾脏、鳃组织中过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性，所有试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司，参照说明书进行检测。吸光度使用NP80型超微量分光光度计进行测定。得到结果代入公式1、公式2、公式3计算。由于酶活计算时需要各组织的蛋白浓度，所以使用试剂盒对各组织蛋白浓度进行测定并代入公式(见图1)计算。
(公式1)
注释：X1代表对照OD值，X2代表测定OD值，下同。
(公式2)
(公式3)
2.4. 数据处理
使用WPS office和SPSS 22.0软件对数据进行处理及图表、表格的制作。统计值为平均值 ± 标准差，在单因素方差分析的基础上采用多重比较，P < 0.05代表数据之间存在显著差异。
3. 结果
3.1. MS-222麻醉下鲢生理行为观察
3.1.1. 鲢麻醉及复苏阶段行为特征
在麻醉剂MS-222对鲢持续作用条件下，不同浓度麻醉下鲢的行为特征及生理状态往往差别较大。本试验观察，参照杜浩、刘长琳等 [12] [27] 对鱼类麻醉与苏醒的分期，可将鲢的麻醉期间分为五个阶段，其行为特征见表1、苏醒期分为三个阶段，其特征详见表2。并结合本试验，将3 min内进入麻醉阶段A4期，5 min内进入恢复R3期的浓度定义为有效浓度。
3.1.2. 麻醉状态下鲢呼吸频率变化
呼吸频率是鲢生理指标中重要的一部分，能够较为直观的反应其麻醉程度。鲢在MS-222药物不同浓度下的呼吸频率如图2所示。在MS-222浓度为50 mg/L的溶液中，鲢的呼吸频率出现小幅度上升后平稳下降。浓度分别为70、90、110、130 mg/L的溶液中，鲢的呼吸频率呈明显下降趋势且未出现小幅度上升，与对照组相比具有显著差异，期间伴随着强烈的应激反应，如迅猛游动，撞击桶壁等。在MS-222浓度为110 mg/L、130 mg/L的溶液中，呼吸频率分别与对照组、50 mg/L、70 mg/L浓度组相比差异显著。由此证明，随着MS-222麻醉剂浓度的不断增加，鲢的呼吸频率下降速度不断增加。这与郭丰红等研究MS-222对鳜的麻醉效果的研究结果一致 [20] 。
Table 1. Behavior pattern of silver carp anesthetized during anesthetic stages
表1. 鲢麻醉各阶段的行为状况
Table 2. Stages of recovery and behavioral characteristics of silver carp
表2. 鲢复苏阶段分期及各阶段行为特征
Figure 2. Changes of respiratory rate of silver carp under different concentrations of MS-222
图2. MS-222不同浓度下鲢呼吸频率的变化
3.1.3. 不同浓度下鲢进入不同麻醉阶段及复苏阶段的诱导时间
在Ms-222不同浓度溶液下将鲢放入麻醉液中，当鲢进入深度麻醉后再将鱼从麻醉溶液中捞出，放入清水中供氧复苏。观察并记录。具体诱导与复苏时间分别见表3、表4。结果表明，在MS-222浓度为50 mg/L和浓度为70 mg/L的溶液中，鲢进入深度麻醉期的时间较长，平均分别为13 min、8 min，但二者之间差异不显著。在MS-222浓度为90 mg/L的溶液中，鲢进入深度麻醉期的时间平均为6 min，与浓度为50 mg/L麻醉时间差异显著。而在浓度为110 mg/L和130 mg/L的溶液中，鲢能迅速进入深度麻醉期(3.52 min, 2.85 min)，与浓度分别为50 mg/L、70 mg/L、90 mg/L相比，差异显著。进入深度麻醉后，对鲢进行复苏操作，结果表明：鲢的复苏时间与MS-222麻醉剂浓度密切相关。在MS-222浓度为50 mg/L和浓度为70 mg/L的溶液中，鲢进入深度麻醉期后仍然保持轻微呼吸，并在3 min左右身体恢复平衡，缓慢游动；在浓度分别为90 mg/L、110 mg/L和130 mg/L的溶液中，鲢能表现出明显的阶段性恢复过程，且差异显著。
Table 3. Induction time of silver carp in different anesthesia stages under different concentrations of MS-222
表3. MS-222不同浓度下鲢进入不同麻醉阶段的诱导时间
注：不同字母表示数值之间存在显著差异(P < 0.05)；“—”表示该阶段表现不明显或急促，未观察到该阶段。
Table 4. Induction time of silver carp entering different recovery stages at different concentrations
表4. 不同浓度下鲢进入不同复苏阶段的诱导时间
3.2. 麻醉剂MS-222长效麻醉下鲢生化指标变化
鲢在MS-222浓度分别为10、20、30 mg/L溶液中，分别在麻醉为1、3、6、12、24 h时，对其组织的肝、脾、鳃组织进行酶活测定，酶活具体指标分别为CAT活性，ACP活性，AKP活性。
3.2.1. MS-222对鲢组织CAT活性的影响
MS-222对鲢CAT活性影响如表5所示。在同一时间下，鲢肝组织试验组CAT活性相对于对照组均有一定程度的下降，且差异显著。30 mg/L麻醉浓度组酶活总体高于10 mg/L麻醉浓度组但低于对照组，且差异显著；20 mg/L麻醉浓度组酶活虽在3 h后高于10 mg/L浓度组，但差异不显著。在相同浓度下，其他时间点酶活性均低于1 h酶活性，且差异显著，在3 h后基本保持稳定，差异不显著。在同一时间下，10 mg/L麻醉浓度组鲢脾脏组织中酶活相比对照组有明显下降趋势，且差异显著。但在20、30 mg/L麻醉浓度组相比对照组，鲢酶活虽有一定程度下降，但是差异不显著。在相同浓度下，10 mg/L的麻醉浓度组鲢脾组织的CAT活性在3 h出现上升现象后保持稳定，在20 mg/L的麻醉浓度下，鲢活性在下降3 h后保持平稳；30 mg/L的麻醉浓度下，鲢活性则持续下降直至12 h保持平稳，且差异都不显著。在10 mg/L的麻醉浓度下，鲢鳃组织中CAT活性在1 h呈现一定的上升趋势且高于对照，3 h后逐渐下降至对照以下，且差异显著。但在20 mg/、30 mg/L的浓度下，下降趋势明显，在6 h后保持平稳，差异不显著。
Table 5. Changes of CAT activity in various tissues of silver carp
表5. 鲢各组织CAT活性变化
注：不同大写字母表示同一浓度不同麻醉时间之间存在显著差异(P < 0.05)；不同小写字母表示同一时间不同麻醉浓度之间存在显著差异(P < 0.05)。
3.2.2. MS-222对鲢组织ACP活性的影响
MS-222对鲢ACP活性影响如表6所示。在相同时间下，试验组鲢肝组织中ACP活性相比于对照组ACP活性均有上升的趋势，差异显著。在浓度不变条件下，10 mg/L麻醉浓度溶液中，鲢活性虽出现上升，并在后续保持一定平稳，而分别在20、30 mg/L的麻醉浓度下鲢活性上升后在1 h下降，在6 h后保持平稳，但差异均不显著。10 mg/L麻醉浓度的鲢脾脏组织中ACP活性上升到3 h后出现迅速下降现象，随后保持平稳，差异不显著；分别在20 mg/、30 mg/L的麻醉浓度下，鲢脾组织的ACP活性总体出现一定趋势的下降，差异显著；而在同一浓度下，随着时间增加，各浓度下酶活都呈下降趋势，且差异显著。各试验组的鲢鳃组织中ACP活性总体均高于对照组，差异显著。而在同一浓度下，10 mg/L麻醉浓度组鲢ACP活性呈现先上升再下降，随后保持稳定趋势，但差异不显著；分别在20 mg/、30 mg/L的麻醉浓度组，鲢ACP活性下降趋势明显，在6 h后保持平稳，差异亦不显著。
Table 6. Changes of ACP activity in various tissues of silver carp
表6. 鲢各组织ACP活性变化
注：不同大写字母表示同一浓度不同麻醉时间之间存在显著差异(P < 0.05)；不同小写字母表示同一时间不同麻醉浓度之间存在显著差异(P < 0.05)。
3.2.3. MS-222对鲢组织AKP活性的影响
MS-222对鲢ACP活性影响如表7所示。试验组鲢肝组织的ACP活性相对于对照组总体呈现出先上升后下降的趋势，差异显著。在10 mg/L麻醉浓度组，活性在3 h上升后保持一定平稳，差异不显著，而在20、30 mg/L的麻醉浓度下活性则在1 h时上升，在3 h后迅速下降保持稳定，差异亦不显著。在相同时间下，10 mg/L麻醉浓度组鲢脾脏组织CAT活性显著高于对照组以及麻醉浓度分别为20、30 mg/L组。而麻醉浓度为20、30 mg/L组的活性水平相似，差异亦不显著。在10 mg/L麻醉浓度组，鲢脾组织的AKP活性上升到3 h后出迅速下降，在6 h后保持平稳，但差异不显著；在20 mg/L的麻醉浓度组，鲢脾组织的AKP活性在1 h出现略微上升，随后缓慢下降在12 h保持平稳；在30 mg/L的麻醉浓度组，鲢AKP活性则始终呈现一定的波动，但两者差异都不显著。
Table 7. Changes of AKP activity in various tissues of silver carp
表7.鲢各组织AKP活性变化
注：不同大写字母表示同一浓度不同麻醉时间之间存在显著差异(P < 0.05)；不同小写字母表示同一时间不同麻醉浓度之间存在显著差异(P < 0.05)。
4. 讨论
4.1. MS-222对鲢麻醉适宜的浓度范围
本试验鲢规格体质量为105 g左右，在水温17℃左右，持续供氧条件下，MS-222麻醉溶液在110~130 mg/L浓度时，鲢在3 min左右时间内进入深度麻醉期，麻醉后移放至清水水体5 min后可复苏，其对鲢伤害较小。实验表明，MS-222高浓度溶液(110~130 mg/L)适合对鲢鱼种进行短时间操作，如短距离运输、手术、标记、生物学测定等短时间操作。MS-222溶液在20~30 mg/L的浓度下，麻醉剂能够在24 h及以上时间对鲢鱼种起持续作用，适合对其进行较长时间运输作业，如长途鲜活鲢运输等。对商品鲢(规格>1100 g)运输，水温12℃~15℃时，其MS-222适合浓度10~25 mg/L，运输时间70~73 h，成活率可达100% [26] 。综合可得水温12℃~17℃下，MS-222溶液浓度20~25 mg/L可作为鲢鱼种和商品鲢远程运输较合适的浓度。
4.2. MS-222对鲢麻醉后各组织酶活性的影响
CAT广泛分布于生物体中，具有特定的催化作用，可以降解H2O2，并存在于过氧化物酶体中 [22] 。体内某些活性氧，自由基和对身体有毒的物质，需要CAT来清除。因此，MS-222作为一种具有高活性氧的麻醉剂，作用于鲢后使其体内产生大量自由基，引起机体CAT酶的变化。本试验中，鲢各组织CAT酶都出现了一定下降的趋势。MS-222在10 mg/L麻醉浓度下，鲢肝和脾组织的CAT活性下降最为迅速，且差异显著；在20~30 mg/L的麻醉浓度下肝和脾组织的CAT活性下降缓慢，并逐渐保持稳定。在10 mg/L的MS-222麻醉剂浓度下，麻醉剂对鲢的影响较小；在20~30 mg/L的麻醉浓度下，其对鲢始终起作用。
ACP是在酸性条件下催化磷酸单酯水解以及磷酸酶代谢的酶，溶酶体生理功能与ACP也密切相关，构成溶酶体的重要部分，同时在吞噬和包囊反应中，通常伴随着ACP的释放。本试验中，鲢各组织的ACP活性在各个时间点均高于对照组，且20~30mg/L的麻醉浓度下各组织的ACP活性下降较慢，最终低于对照组，说明在短时间内该浓度下鲢体内的ACP始终在组织内参与反应，而随着麻醉剂的不断富集，导致ACP活性最终低于对照组。
作为体内非常重要的调节酶，AKP直接参与磷酸基团的转移，并在免疫系统的调节中起重要作用 [27] 。本试验，鲢肝脏和脾脏部位在1 h时，各个MS-222麻醉浓度组的AKP活性均高于对照组，在3 h后出现下降情况，在麻醉前期，麻醉剂对鲢具有显著的效果。在20~30 mg/L的麻醉浓度下，试验组鲢组织AKP活性低于对照组，可能是浓度过高，导致1 h前已经出现下降现象，而升高现象并未观测到。但是该浓度下AKP酶在1 h后基本保持稳定，可能是该浓度下麻醉剂对鲢始终具有麻醉效果。
5. 小结
本实验对鲢麻醉效果研究表明MS-222溶液在高浓度条件下，110~130 mg/L为有效浓度，麻醉效果最好，适合对鲢进行短时间(0.5~2.0 h)操作。在MS-222浓度为110、130 mg/L的溶液中，呼吸频率分别与0 mg/、50 mg/、70 mg/L浓度组相比差异显著，随着MS-222麻醉剂浓度的不断增加，鲢的呼吸频率下降速度不断增加。在MS-222溶液低浓度条件下，20~30 mg/L浓度鲢麻醉试验组的酶活性高于对照组(未麻醉长丰鲢组)，且在一定时间内保持稳定，说明对鲢鱼种在长时间内保持麻醉效果，适宜对鲢进行长途运输。
基金项目
财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系项目(CARS-45-01)；中国水产科学研究院基本科研业务费(2020TD33)；国家淡水水产种质资源库(FGRC18537)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。