基于网络药理学和分子对接技术探讨淫羊藿–女贞子治疗绝经后骨质疏松症的作用机制

Mechanism of Epimedia-Ligustrum in Treat-ing Postmenopausal Osteoporosis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Technology

摘要: 目的：运用网络药理学和分子对接技术分析淫羊藿–女贞子治疗绝经后骨质疏松的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选淫羊藿–女贞子的有效活性成分及对应靶点。人类基因数据库(Genecards)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、DisGeNET数据库获取绝经后骨质疏松的相关靶点。使用Venn2.1.0在线平台获取药物与疾病的交集靶点，利用STRING在线数据库构建交集靶点的蛋白相互作用关系，并使用Cytoscape3.9.1软件构建网络图。通过Metascape数据库对交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析并使用微生信平台绘图，使用Cytoscape3.9.1软件构建淫羊藿–女贞子治疗绝经后骨质疏松的“药物成分–靶点–通路”网络图。最后运用PyMOL等软件对淫羊藿–女贞子的主要活性成分与关键靶点进行分子对接验证。结果：共得到淫羊藿–女贞子活性成分27个，活性成分相关靶点233个；GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库得到绝经后骨质疏松相关靶点1083个，经Venn2.1.0在线平台得到交集靶点80个。共筛选到27中有效成分，主要有效成分有：槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、大黄素(emodin)、脱水淫羊藿素(Anhydroicaritin)等，AKT1 (蛋白激酶1)、IL-6 (白细胞介素-6)、TNF (肿瘤坏死因子)、VEGFA (血管内皮生长因子)、IL-1β (白细胞介素-1β)、MMP9 (基质金属蛋白酶-9)、PTGS2 (前列腺素内过氧化物合酶2)、CCL-2 (淋巴细胞趋化因子-2)、CXCL8 (白细胞介素-8)、EGF (表皮生长因子)，为淫羊藿–女贞子治疗绝经后骨质疏松的核心靶点。GO和KEGG分析结果表明淫羊藿–女贞子治疗绝经后骨质疏松主要涉及细胞分化的负调控、细胞对脂质、脂多糖、细菌来源的反应等生物过程；主要通过参与癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等作用于绝经后骨质疏松。分子对接结果表明，羌活胜湿汤中槲皮素、山柰酚、木犀草素等5个主要活性成分与AKT1、IL-6、TNF等5个关键靶点有着较好的亲和力。结论：淫羊藿–女贞子可以通过槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、大黄素(emodin)、脱水淫羊藿素(Anhydroicaritin)等成分与AKT1 (蛋白激酶1)、IL-6 (白细胞介素-6)、TNF (肿瘤坏死因子)、VEGFA (肿血管内皮生长因子)、IL-1β (白细胞介素-1β)、MMP9 (基质金属蛋白酶-9)、PTGS2 (前列腺素内过氧化物合酶2)、CCL-2 (过淋巴细胞趋化因子-2)、CXCL8 (白细胞介素-8)、EGF (表皮生长因子)等靶点产生相互作用，调节AGE-RAGE信号通路、TNF、PI3K-Akt、GFR等通路实现治疗绝经后骨质疏松的作用。

Abstract: Objective: This paper aims to analyze the mechanism of Epimedia-Ligustrum in treating postmen-opausal osteoporosis by network pharmacology and molecular docking. Methods: The active com-ponents and corresponding targets of Epimedia-Ligustrum were screened using the Systematic Pharmacology Database and Analysis platform (TCMSP). The Human Genetic Database (Genecards), online Human Mendelian Genetic Database (OMIM) and DisGeNET database were used to obtain the relevant targets of postmenopausal osteoporosis. The Venn2.1.0 online platform was used to obtain the intersection targets of drugs and diseases, the protein interaction relationship of intersection targets was constructed using STRING online database, and the network diagram was constructed using Cytoscape3.9.1 software. The GO and KEGG pathway enrichment analysis of intersection tar-gets was carried out through Metascape database, and the mapping was carried out using Weishengxin platform. The “drug component-target-pathway” network map of Epimedia-Ligustrum in the treatment of postmenopausal osteoporosis was constructed using Cytoscape3.9.1 software. Finally, PyMOL software was used to verify the molecular docking between the main active compo-nents and key targets of Fructus herba. Results: A total of 27 active constituents and 23 related targets of active constituents were obtained. 1083 targets related to postmenopausal osteoporosis were obtained from GeneCards, OMIM and DisGeNET databases, and 80 intersecting targets were obtained from Venn2.1.0 online platform. A total of 27 active ingredients were screened, and the main active ingredients were: quercetin, luteolin, kaempferol, emodin, Anhydroicaritin, etc. AKT1 (protein kinase 1), IL-6 (interleukin-6), TNF (tumor necrosis factor), VEGFA (vascular endothelial growth factor), IL-1β (interleukin-1β), MMP9 (matrix metalloproteinase-9), PTGS2 (prostaglandin peroxidase synthase 2), CCL-2 (lymphocyte chemokine-2), CXCL8 (Interleukin-8) and EGF (epider-mal growth factor) are the core targets of Epimedia-Ligustrum in the treatment of postmenopausal osteoporosis. The results of GO and KEGG analysis showed that the treatment of postmenopausal osteoporosis mainly involved the negative regulation of cell differentiation, cell response to lipids, lipopolysaccharides and bacteria. It mainly plays a role in postmenopausal osteoporosis by partici-pating in cancer pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, interleukin-17 signaling path-way, PI3K-Akt signaling pathway, MAPK signaling pathway, etc. The molecular docking results showed that quercetin, kaempferol and luteolin in Qiangshengsheng Decoction had good affinity with five key targets such as AKT1, IL-6 and TNF. Conclusion: The protein kinase 1 (AKT1) and IL-6 (leucocytic agent) can be combined with quercetin, luteolin, kaempferol, emodin and Anhydroicari-tin Tin-6), TNF (tumor necrosis factor), VEGFA (vascular endothelial growth factor), IL-1β (interleu-kin-1β), MMP9 (matrix metalloproteinase-9), PTGS2 (prostaglandin peroxidase synthase 2), CCL-2 (hyperlymphocyte chemokine-2), CXCL8 (interleukin-8), EGF (epidermal growth factor) and other targets interact, regulating AGE-RAGE signaling pathway, TNF, PI3K-Akt, GFR and other pathways to achieve the treatment of postmenopausal osteoporosis.

1. 引言

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis, PMOP)属于原发性骨质疏松疾病，一般女性进入绝经期后5~10年内 [1] ，由于体内的激素水平 [2] 、氧化应激反应 [3] 、肠道菌群 [4] 等因素的影响，从而打破体内骨质的形成和再吸收的平衡，引起骨代谢紊乱，导致骨量的丢失和骨强度的减弱，诱发骨质疏松 [5] 。临床表现为疼痛、脊柱畸形、甚至脆性骨折，严重影响影响患者的生活质量，并可能缩短其寿命。

“绝经后骨质疏松症”在中医学中根据其病发症候可归于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等。春秋战国时代《内经》首次记载“骨痿”一词，还有“肾脂枯不长”为骨痹、“骨枯而髓减”为骨痿的记载，《素问·痿论》云：“黄帝问曰：五脏使人痿，何也？……发为骨痿”。《灵枢·经脉》曰：“足少阴气绝，则骨枯”。淫羊藿温肾壮阳、女贞子滋补肝肾之阴，两药相合，有调和阴阳、益肾健骨的功效。通过总结国家级名老中医李世增教授50余年的临床经验处方筛选出治疗绝经后骨质疏松的药对：淫羊藿–女贞子。但目前对于“淫羊藿–女贞子”治疗绝经后骨质疏松的作用机制研究尚处于起步探索阶段，本研究拟采用网络药理学方法分析淫羊藿女贞子中各成分作用的靶点、通路，并预测其治疗绝经后骨质疏松的作用机制 [6] ，为后续临床应用及实验研究提供理论支撑。

2. 材料与方法

2.1. 中药淫羊藿–女贞子化学活性成分筛选及靶点预测

首先，在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)中以“淫羊藿–女贞子”为关键词检索 [7] ，根据口服利用度(OB) ≥ 30%，类药物参数(DL) ≥ 0.18筛选2味中药的有效活性成分；其次，未满足上一筛选条件的有效成分，通过中国知网、万方数据知识服务平台检索收集已通过验证的有效成分，纳入分析。最后，根据初步筛选后获取各中药成分相关作用靶点，将靶点数据录入UniProt数据库对其蛋白名称标准化。

2.2. 绝经后骨质疏松靶点获取

在人类基因数据库(Genecards)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、DisGeNET数据库以“postmenopausal osteoporosis”作为检索词 [7] ，获取绝经后骨质疏松相关疾病靶点。通过Venn2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线平台获取药物和疾病的交集靶点韦恩图。

2.3. 中药–活性成分–靶点网络构建

将中药、活性成分、靶点信息整理导入Cytoscape3.9.1软件构建网络图，进行可视化分析。

2.4. 蛋白质相互作用关系网络构建

将药物和疾病的交集靶点导入STRING在线数据库,设置Organism为“Homosapiens”，构建交集靶点之间的蛋白相互作用网络关系(protein-proteininteraction, PPI)，并通过Cytoscape3.9.1绘制PPI网络图。

2.5. GO富集分析与KEGG富集分析

将交集靶点导入Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)在线数据库，物种设置为智人(H.sapiens)，选择个性化分析，分别进行基因本体(geneontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。通过微生信平台 (http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制GO柱状图与KEGG气泡图。

2.6. 分子对接

根据PPI分析结果选取疾病核心靶点分别与药物关键成分进行分子对接：从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心蛋白基因的3D结构，利用PyMOL软件对蛋白质进行去水、去配体等操作；在TCMSP数据库中根据关键活性成分Chemicalname查找女贞子、淫羊藿活性成分的化合物名称获取相应化合物3D结构式保存为mol2格式，通过AutoDockTools1.5.7软件将核心蛋白基因及化合物加氢、平衡电荷处理保存为pdbqt格式并定义活性口袋，最后运行AutoDockTools软件进行对接并利用PyMOL软件对分析结果可视化。

3. 结果

3.1. 淫羊藿–女贞子中药化学成分及靶点筛选结果

通过TCMSP数据库及中国知网等期刊查找共得到38个符合条件的活性成分，剔除无对应靶标的成分，最终得到27个活性成分，其中淫羊藿22个，女贞子8个(见表1)。预测得到淫羊藿、女贞子药物靶点233个。

Table 1. Ingredient list of Mongolian medicine Epimedia-Ligustrum

表1. 淫羊藿–女贞子主要活性成分

3.2. 绝经后骨质疏松靶点预测及药物治疗绝经后骨质疏松潜在作用靶点的预测

通过GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库，去重后得到绝经后骨质疏松相关疾病靶点1083个。通过Venn2.1.0平台对两组靶点取交集，获得淫羊藿、女贞子治疗绝经后骨质疏松的潜在作用靶点80个(见图1)。

Figure 1. Intersection target

图1. 交集靶点

3.3. PPI网络图分析

将交集基因上传到STRING数据库，得到PPI网络，使用Cytoscape3.9.1进一步分析PPI网络，根据连接Degree值重新绘制PPI网络图，节点越大颜色越深表明Degree值越大，则该节点在网络中越重要(见图2)。通过CytoHubba插件分析网络中关键子网络，根据Degree值大小，得到排名前10名的靶点(见图3)。

根据Degree值排序前10位依次为：AKT1 (蛋白激酶1)、IL-6 (白细胞介素-6)、TNF (肿瘤坏死因子)、VEGFA (肿血管内皮生长因子)、IL-1β (白细胞介素-1β)、MMP9 (基质金属蛋白酶-9)、PTGS2 (前列腺素内过氧化物合酶2)、CCL-2 (淋巴细胞趋化因子-2)、CXCL8 (白细胞介素-8)、EGF (表皮生长因子)，预测其为羌活胜湿汤治疗绝经后骨质疏松的关键靶点。

Figure 2. PPI network of Cytoscape3.9.1 analysis

图2. Cytoscape3.9.1分析所得PPI网络

Figure 3. Core target network

图3. 核心靶点网络

3.4. GO与KEGG富集分析结果

使用Metascape平台进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，并通过在线绘图工具微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制条形图与气泡图。如图4所示，淫羊藿–女贞子干预绝经后骨质疏松参与的BP有对脂多糖的应答(response to lipopolysaccharide)、对缺氧的应答(response to hypoxia)、对外源性刺激的应答(response to xenobiotic stimulus)、基因表达的正调控(positive regulation of gene expression)；CC主要有血小板颗粒腔(platelet talphagranule lumen)、小窝(caveola)、膜筏(membrane raft)等；MF主要有蛋白酶结合(protease binding)、血红素结合(heme binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、酶结合(enzyme binding)等。通过Metascape对淫羊藿–女贞子干预绝经后骨质疏松的基因进行KEGG通路富集分析，共获得160条通路，显著性最大的前20条通路见图5，可以发现主要集中于AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、癌症通路(pathways in cancer)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、前列腺癌信号通路(Prostate cancer)、表皮生长因子受体信号通路(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)等。

3.5. 药物成分–靶点–通路网络图分析

使用Cytoscape3.9.1软件构建淫羊藿–女贞子“药物成分–靶点–通路”网络图，节点越大颜色越深表明其对绝经后骨质疏松的作用越大。可以发现在网络中，每个成分对应多个靶点，每个靶点又与多个活性成分相互作用，表明淫羊藿–女贞子通过多成分、多靶点、多通路干预绝经后骨质疏松，见图6。通过Cytoscape3.9.1软件中内置的AnalyzeNetwork工具分析各节点网络拓扑学参数，排名最高及相关性较强的活性成分是槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、山奈酚(Kaempferol)、大黄素(Emodin)、脱水淫羊藿素(Anhydroicaritin)，这5种活性成分可能是淫羊藿–女贞子药对治疗绝经后骨质疏松的主要成分。

3.6. 分子对接结果

通过TCMSP数据库获得槲皮素、山奈酚、木犀草素、大黄素、脱水淫羊藿素的3D结构式，PDB数据库获得AKT1、IL-6、TNF、MMP9、VEGFA的3D结构式，处理后进行对接，并用R软件计算结果。以结合能Affinity (kcal/mol)评判对接的判断标准，结合能低于0表明分子间能够自发结合，结合能负值越高提示结合力越强，结果显示活性成分与靶点间对接活性良好(如表2)，亲和力强，证实了研究预测可靠性。选取较强结合活性的槲皮素、山奈酚与AKT1、IL-6将结果利用PyMOL软件可视化(如图7)。

Figure 4. GO enrichment analysis

图4. GO功能富集分析图

Figure 5. KEGG pathway enrichment analysis

图5. KEGG富集分析

Figure 6. Drug component-target-pathway network

图6. 药物成分–靶点–通路网络

Table 2. Molecular docking binding energy meter (Unit: kcal/mol)

表2. 分子对接结合能表(单位：kcal/mol)

(1) quercetin-AKT1 (2) quercetin-IL-6 (3) kaempferol-AKT1 (4) kaempferol-IL-6

Figure 7. Molecular docking model diagram

图7. 分子对接模式图

4. 讨论

绝经后骨质疏松是女性绝经后身体激素发生变化而导致的一种代谢性疾病，日常生活中易发生骨折甚至危及生命健康等情况，严重影响患者的生活质量。从中医角度来说，根据临床症状PMOP属中医学“骨痿”“骨枯”范畴 [8] ，西医目前治疗绝经后骨质疏松主要围绕抑制骨量丢失、增加骨量形成两方面，目前临床用于绝经后骨质疏松的治疗药物多存在较大不良反应，如长期服用双膦酸盐类药物可引起高血钙、下颌骨坏死等不良反应 [9] [10] ；长期服用特立帕肽和阿巴洛肽可引起恶心肿瘤、肌肉痉挛等不良反应 [11] 。所以研究并开发传统中医中药是解决这一问题的有效途径之一。通过“成分–靶点–通路”网络可知，“淫羊藿–女贞子”中的核心成分主要有Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Emodin、Anhydroicaritin等。Huang等 [12] 研究表明，槲皮素能促进成骨，抑制破骨细胞的活性，具有雌激素的作用，可以逆转骨质的减少，维持体内骨量平衡；山奈酚具有抗炎作用，能够减缓绝经后骨质疏松引起的神经根性疼痛，并且可通过激活成骨细胞自噬作用来保护骨骼 [13] [14] 。Zheng等 [15] 研究表明，木犀草素可以通过体内外调节ERK/Lrp-5/GSK-3β信号通路促进成骨细胞分化；木犀草素也可能通过激活PI3K/AKT通路，从而降低破骨细胞数量，改善骨丢失 [16] ；大黄素可以通过抑制miR-338-3p表达、激活ERK/JNK/BMP/Smad信号通路，保护骨量丢失，促进骨质生长 [17] [18] ；Zheng等 [19] 研究表明，脱水淫羊藿素可以抑制破骨细胞形成，保护骨质。通过对PPI网络分析发现，degree值排名靠前的靶点有AKT1、IL-6、TNF、MMP9、VEGFA。研究发现在雌激素缺乏的条件下，女性患者的炎症细胞因子表达升高，IL-6和TNF-α水平是PMOP的独立危险因素，能够增加破骨细胞以及骨吸收，导致绝经后骨质疏松 [20] [21] 。AKT1属于AKT家族，AKT在诱导自噬和促进成骨细胞增殖中有着重要的作用 [22] ，实验研究发现，小鼠在缺失AKT1、AKT2基因表达情况下，出现骨质分化发育缓慢的情况 [23] 。MMP9属于基质金属蛋白酶(MMP)家族成员，MMP主要促进细胞能量转换、参与细胞凋亡，研究表明MMP9能够影响破骨细胞基因表达和骨稳态，从而导致骨质疏松 [24] 。VEGFA是血管内皮生长因子家族成员之一，研究表明VEGF能够促进内皮细胞增殖及新血管生成，加速骨形成及重建过程，直接促进骨髓间充质干细胞及增加成骨细胞的成骨活性，降低破骨细胞溶骨活性来促进骨形成及增加骨密 [25] 。淫羊藿–女贞子可能通过调控这些靶点治疗绝经后骨质疏松。靶标与成分进行分子对接，结合能越小则表明二者对接效果越好，一般以结合能 ≤ −5.0 kJ/mol作为分子对接评价标准 [26] ，通过对排名前5位的成分与PPI网络中排名前5位的靶点进行分子对接，结果显示大部分成分与靶点的结合能均 ≤ −5.0 kJ/mol，表明Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Emodin、Anhydroicaritin这5种核心成分能够有效地结合相关靶点来治疗骨质疏松。通过KEGG通路富集分析，可以发现淫羊藿–女贞子主要通过调AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、EGFR信号通路来治疗绝经后骨质疏松。研究表明，中药复方可通过AGEs-RAGE通路进一步调节NF-κB的表达,达到延缓衰老，缓解骨质疏松进程 [27] 。PI3K-Akt信号通路广泛参与细胞代谢的生理过程。多项研究表明，PI3K/AKT信号通路具有双向调控成骨细胞与破骨细胞的作用，调节骨量代谢，对于维持骨组织结构的稳定具有重要作用 [28] [29] [30] 。研究显示，木犀草素也可能通过激活PI3K/AKT通路，从而降低破骨细胞数量，改善骨丢失 [16] 。实验研究表明，上调小鼠骨内膜骨祖细胞的表达，可通过EGFR信号通路抑制细胞衰老，维持细胞增殖，从而减缓骨质疏松进程 [31] 。

综上所述，可以发现淫羊藿–女贞子主要通过Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Emodin、Anhydroicaritin等成分调控AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、EGFR信号通路等来治疗绝经后骨质疏松，这些预测结果也为后续动物实验、细胞实验提供了理论指导。但本研究还存在一定局限性，今后还需深入挖掘和实验验证。

参考文献