慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化血清诊断标志物

Serum Markers for Liver Fibrosis Assessment in Patients with Chronic Hepatitis B

摘要: 乙型肝炎病毒(HBV)感染发病率高，是全球公共卫生问题之一，我国为高流行地区。HBV感染是引起肝硬化、肝衰竭、肝癌甚至是死亡的主要病因，而肝纤维化是进展为肝硬化的重要阶段，可逆转，对肝纤维化的早期诊断及干预具有重要意义，本文就肝纤维化的血清诊断标志物作一综述。

Abstract: The high incidence of hepatitis B virus infection is one of the global public health problems and China is a high prevalence area. HBV infection is the main cause of cirrhosis, liver failure, liver can-cer and even death. Liver fibrosis is an important stage of cirrhosis, reversible, so early diagnosis and intervention of liver fibrosis is of great significance. This article reviews the serum diagnostic biomarkers for hepatic fibrosis.

1. 引言

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的，主要通过血液、性传播以及垂直传播，HBV感染是全球公共卫生问题之一，全球约有20亿感染，感染率在0.1%~35%，往往导致慢性感染、肝硬化和肝癌，大约15%~40%的慢性感染者会发展为肝硬化、肝功能衰竭或肝细胞癌，每年约造成80万人死亡 [1] 。

我国为慢性乙型病毒性肝炎高度流行地区(≥8%)，不同地区、人群感染差异很大，我国成人的HBsAg患病率为8.5%~10.5% [2] 。我国未经抗病毒治疗CHB患者的肝硬化年发生率为2%~10%，肝硬化患者HCC年发生率为3%~6% [3] 。肝纤维化是肝脏对于各种刺激损伤的修复反应，几乎所有的慢性肝病都与纤维化相关，目前认为肝纤维化是可以逆转的，但一旦进展至肝硬化则很难逆转，纤维化是一个2动态和可逆的过程约70%的HBV和HCV纤维化患者在后续的活检随访中表现出可逆性，活化的肝星状细胞减少对肝纤维化的可逆性至关重要，细胞凋亡、衰老、恢复失活表型三种途径有助于消除纤维化 [4] 。一项研究表明经过5年的抗HBV治疗后，51%的患者肝纤维化逆转消退，87%患者的组织学发生改变 [5] ，对存在肝脏炎症或肝纤维化的患者进行准确评估肝脏损害和早期的干预治疗，可以降低肝硬化和肝癌的发病率，有利于提高患者的生存率和生活质量。准确诊断和评估肝纤维化的严重程度具有重要意义，目前肝活检仍然是肝纤维化诊断的“金标准” [6] ，但存在有创性、并发症(出血、感染、疼痛等)、价格昂贵，对于轻度肝炎的患者难以接受，不能反映肝脏的整体纤维化程度，且不能动态监测等，限制其临床应用。近年来，肝纤维化无创性诊断研究取得新的进展，本文就肝纤维化的血清诊断标志物作一阐述。

2. 血清标志物

2.1. 血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)、IV型胶原(CIV)

透明质酸(HA)是由肝间质细胞产生的一种高分子量糖胺多糖，肝星状细胞参与HA的合成，而窦状内皮细胞则参与其降解，其在肝脏细胞外基质中含量很高，对预测纤维化有很好的诊断价值 [7] ；层粘连蛋白(LN)是细胞基底膜中特殊的非胶原性结构蛋白；Ⅲ型前胶原是氨基酸多肽，其升高直接反映肝纤维化的活动性；IV型胶原构成是基底膜，反映基底膜胶原的更新率，在肝纤维化早期血清中水平就可升高，具有较高的灵敏度；四项指标与纤维化、肝脏炎症显著相关。

王秀丽等研究分析了病毒性肝炎患者，发现随着肝功能受损、纤维化的加重，HA升高，在肝硬化患者中最高，HA与肝纤维化的相关性为0.48，HA > 130 ng/L诊断肝纤维化的灵敏度为60.19%，特异度为85.19% [8] 。张新弟分析了120例HBV感染患者，发现随着肝纤维的进展，血清中层粘连蛋白的水平呈上升趋势，具有统计学意义，可作为早期敏感指标，其可能与门静脉压力升高有关 [9] 。一项肝病患者及健康患者的对照研究，采用Ishak系统进行肝纤维化的分级，发现肝纤维化四项指标与肝脏疾病的发生及发展密切相关，对肝纤维化诊断的曲线下面积(AUC)分别为0.822、0.685、0.765、0.776，其中血清透明质酸诊断肝纤维化的灵敏度为82.06%，特异度为70.19%，III型前胶原诊断灵敏度为70.32%，特异度为79.62% [10] 。一项研究发现ALB (白蛋白)、GGT (γ-谷氨酰转移酶)、透明质酸、IV型胶原是非严重肝纤维的独立危险因素，并建立AGHI模型(AGHI = 2.272 − 0.155 × ALB + 0.047 × GGT + 0.11 × HA + 0.26 × CIV)，其诊断的最佳截断值为−0.326，灵敏度为68.3%，特异性为80.3%，曲线下面积为0.81 (APRI为0.679，FIB-4为0.642)，与纤维化阶段正相关 [11] 。

2.2. 转化生长因子(TGF-β)

转化生长因子(TGF-β)是促纤维化生长因子，对细胞的生长、分化、免疫功能具有调节作用，在肝脏损伤中TGF-β表达增加，可诱发纤维增生、细胞外基质沉积，TGF-β是刺激肝星状细胞和诱导细胞外基质沉积的核心细胞因子，TGF-β信号可通过多条通路参与肝纤维化，被认为是激活肝星状细胞并产生细胞外基质的关键途径 [12] 。

侯步云分析了130例慢性乙性肝炎患者发现TGF-β的含量与肝纤维化的严重程度一致，并与Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸含量呈正相关，相关性分别为0.817、0.682、0.743，是肝纤维化早期诊断的敏感性指标 [13] 。一项实验发现病毒感染可以通过TGF-β1诱导OCT4 (八聚体结合转录因子4)/nanog (同源域蛋白)途径促进肝纤维化基因表达，在HBV合并HCV感染中更加明显，在HBV感染患者的肝活检中，OCT4/Nanog蛋白表达与纤维化分期呈正相关 [14] 。一项分析血清透明质酸、IV型胶原、单胺氧化酶及转化生长因子联合检测对肝纤维化的诊断的研究发现，与肝纤维化(Metavir评分大于F2)的相关性分别为0.32、0.42、0.54、0.61，TGF-β诊断肝纤维化的截断值为14.8 ng/ml，敏感性为66%，特异性为71%，四项指标联合检测的曲线下面积为0.84 [15] 。

2.3. 高尔基体跨膜糖蛋白(GP73)

高尔基体跨膜糖蛋白(GP73)是高尔基体的膜蛋白，大小约73 kda，该蛋白在许多上皮细胞中表达(GP73mRNA在结肠、胃、前列腺和气管组织中表达，骨骼肌中较少)，其表达与病毒感染相关，在正常肝脏中在胆道上皮细胞中表达，肝细胞很少表达，在成人巨细胞肝炎中其表达的显著增加 [16] 。在由CCL4诱导的小鼠纤维肝化模型中发现小鼠GP73蛋白明显升高，肝纤维化小鼠模型血清gp73蛋白水平为285 ± 16 ng/ml，对照组为204 ± 20 ng/ml，可能与胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3过表达有关 [17] 。

GP73可反应映肝脏的损害程度，显著肝纤维化组患者的血清GP73显著高于轻度肝纤维化组患者，差异有统计学意义，王春艳等研究分析了322例慢性乙性肝炎患者，发现GP73在显著肝纤维的患者中明显高于无/轻度肝纤维化患者，相关系数为0.536，显著肝纤维化组(S大于2) GP73界值为102.8 ng/ml，与肝纤维化严重程度正相关，可作为肝脏炎症及肝纤维化的独立风险预测因素，可为抗病毒治疗的补充标准 [18] 。乐萍等分析了148例慢性乙性肝炎患者，发现GP73与临床常用的APRI (APRI = AST × 100/PLT)、S指数[S指数 = (100 × GGT)/(PLT × Alb)]均有较好的相关性(AST：天门冬氨酸氨基转氨酶，PLT：血小板，GGT：γ-谷氨酰基转移酶，Alb：白蛋白)，其诊断显著肝纤维化(Scheuer评分S2-4)的曲线下面积为0.75，特异性为80%，敏感性为67.60%，与fibrotst、APRI以及S指数联合预测曲线下面积为0.813，阳性预测值81.50%，阴性预测值74.50% [19] 。Meijuan Wei分析了220例ALT (丙氨酸氨基转移酶)正常或轻度升高(<2倍正常上限)的慢性乙肝患者，发现其诊断显著纤维化(Scheuer评分大于S2)的最佳临界值为84.49 ng/ml，曲线下面积为0.742，特异性为96.23%，敏感性为30.70%。该团队建立了预测纤维化模型，纤维化概率 = 9.42 + 1.89 Ln(GP73) − 2.63 Ln(PLT)，纤维化的临界值为3.7，诊断率为69.55%，研究发现GP73与AST、Alb是肝炎及肝纤维化的独立预测因素，但其预测肝脏炎症效能更佳，曲线下面积为0.806 [20] 。

2.4. 多糖酶3样蛋白1 (CHI3L1)

多糖酶3样蛋白1 (CHI3L1)是糖基水解酶蛋白家族中的一员，又被称为YKL-40，由中性粒细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等细胞产生，参与组织的损伤与修复，在多种疾病中表达升高，如肝纤维化、哮喘、炎症性肠病、自身免疫性疾病以及脑胶质瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌等癌症疾病。CHI3L1与许多肝脏疾病的自然病程以及严重程度相关，在肝炎、肝纤维化、肝硬化中呈递增关系，与天门冬氨基氨酸转移酶、γ-谷氨酰转移酶等反应肝功能指标、FIB-4 [FIB-4 = (年龄 × AST)/(PLT × ALT^1/2)]正相关，且能监测肝纤维的变化 [21] 。

莫慧玲等分析了400例慢性肝病患者及60例健康患者，结果显示CHI3L1诊断有无肝纤维的AUC为0.83，灵敏度、特异度分别为59.3%、95.45%，阈值为81.6 ng/ml，且随着纤维化的进展而逐渐升高；诊断显著肝纤维化(Scheuer评分系统S2~S4)的AUC为0.847，灵敏度为75.86%，特异度为79.62%，高于肝纤维化4项(透明质酸、III型前胶原N端肽、层粘连蛋白、IV型胶原)的单独检测 [22] 。一项来自浙江大学附属第一医院的研究，显著肝纤维化(肝穿Scheuer 评分系统大于S2)患者血清CHI3L1水平较无显著纤维化患者明显升高，CHI3L1预测显著纤维化的特异性和敏感性分别为75.60%和59.10%，AUC为0.728；CHI3L1随着肝脏硬度值升高而升高，显著肝纤维化(METAVIR, F ≥ 2)其中位浓度为81.9 ng/mL，无显著纤维化(F < 2)中位浓度为56.5 ng/mL，并发现CHI3L1预测显著性肝纤维化效果优于APRI评分(AUC = 0.583)，可作为抗病毒治疗患者(F ≥ 2)的参考，是肝纤维化潜在的生物学标志物 [23] 。一项多中心研究分析了685例ALT正常和轻度升高(ALT < 正常上限2倍)的慢性乙型肝炎患者，经肝穿刺活组织检查发现慢性乙肝患者的血清CHI3L1与纤维化分期呈线性相关，证实血清YKL-40水平与透明质酸、层粘连蛋白、III型前胶原、胶原蛋白、AST正相关，并建立YKL-40模型[YKL-40 model = 0.32 × AST − 0.012 × PLT + 0.012 × HA + 0.846 × lg(YKL-40) − 4.752]，其预测显著纤维化(Ishak评分 > F3)的整个队列曲线下面积为0.801，验证组为0.831，特异性为85.33%，敏感性为71.79%；实验组曲线下面积为0.786 (APRI为0.736，FIB-4为0.735)，特异性为72.85%，敏感性为71.74%，在诊断显著纤维化方面优于APRI、FIB-4 [24] 。

2.5. 白细胞介素(IL)

白细胞介素是炎症介质，也是免疫调节因子，参与机体免疫、肝星状细胞活化，与肝纤维化发生相关，有研究及临床试验发现IL-2、IL-4、IL-10与肝纤维化呈负相关，IL-17、IL-26、IL-27、IL-34、IL-35、IL-37与纤维化呈正相关。

张佳光和同事分析了肝纤维化与IL-2、IL-4、IL-10、IFN-r的关系，发现慢性乙型肝炎患者血清IL-2、IL-4、IL-10含量与肝纤维化、肝脏炎症呈负相关，与纤维化的相关系数分别为−0.625、−0.608、−0.643 [25] 。王楠也发现在慢性乙肝患者中IL-2与肝纤维化程度呈负相关，对于无纤维化患者IL-2含量为122.03 ± 24.58 pg/ml，轻度纤维化为98.23 ± 21.16 pg/ml，相关性为−0.736 [26] 。一项与健康体检者的对照研究发现，血清IL-17、IL-35与补体C3、C4与慢性乙型肝炎患者的肝纤维化相关，是肝纤维化的独立性影响因素，发现随着肝纤维化的加重，体内IL-17、IL-35水平升高，与肝纤维化的回归系数为0.748、0.693 [27] 。一项国外研究发现IL-37与肝硬化患者疾病严重程度呈正相关，可能与其抑制免疫相关，在小鼠模型中转基因表达IL-37可减少肝脏损伤，延长生存期，IL-37依赖机制可能是未来肝纤维化治疗靶点 [28] 。IL-34主要在肝成纤维细胞上表达，日本学者研究发现IL-34是非酒精性肝病患者肝纤维化的独立因素，并建立了基于IL-34的纤维化评分模型，其诊断敏感性和特异性分别为75.20%和85.00% [29] 。我国学者评估IL-34在HBV感染患者肝纤维的诊断价值，参与者都行肝脏穿刺活检，发现IL-34与肝纤维化程度呈正相关，相关系数为0.521，评估严重纤维化(S3、S4)的曲线下面积为0.951，大于谷氨酰转肽酶(0.823)及血小板(0.711)，联合检测时诊断率增加，并建立了基于IL-34、PLT、GGT和A/G (白蛋白与球蛋白比)检测纤维化模型，回归方程F = −7.504 + 0.607 × IL-34 − 0.019 × PLT + 0.061 × GGT − 1.993 × A/G [30] 。

2.6. 血清25羟维生素D3 [25(OH)D3]

25羟维生素D在肝脏中产生，维生素D调节机体钙、磷代谢，具有调节机体免疫、调节细胞增殖、分化、抗纤维化等作用，其缺乏与肝纤维化进展相关，可能与抑制肝星状细胞增殖和细胞外基质成分的过度沉积有关。邓文升等构建CCL4诱导的肝纤维化小鼠模型，予以1.25(OH)2D3治疗，转化生长因子β1表达下降(48834.1 ± 6231.4)，未治疗为(169968.7 ± 38663.8)，进而减低肝星状细胞的激活，抑制肝纤维化，差异有统计学意义 [31] 。

一项来自芬兰的前瞻性研究，随访了13,807例健康受试者，中位随访时间为13.4年，发现维生素D每1 nmol/L与晚期肝病事件(与肝病相关的住院、癌症或死亡)发生相关风险比为0.972，与肝病、肝纤维化、肝细胞癌发生机制有关。在普通人群中，低维生素D可以预测肝脏相关事件 [32] 。张利娟等分析了121例慢性乙性肝炎患者，采用Fibrosan进行肝纤维化分组，发现维生素D严重缺乏组(25(OH)D3小于10 ng/ml)的纤维化程度显著高于维生素D充足组，高龄、低水平25(OH)D3、高凝血酶原时间是重度肝纤维化的独立危险因素 [33] ，补充维生素D可能对慢性肝病的治疗有益。

2.7. 其他

血清脂联素(APN)：脂联素是由脂肪细胞分泌的细胞因子，具有调节脂质代谢、抗炎等作用，在一定程度上预测肝纤维化严重程度。符辉等分析了血清脂联素与肝纤维化4项比较发现，血清脂联素与慢性性病毒性肝炎肝纤维化疾病进展中逐渐升高，并与III型前胶原、IV型胶原、透明质酸、层黏连蛋白相比有较好的相关性，相关系数分别为0.562、0.601、0.487、0.524 [34] 。

血清人尾肢同源蛋白2 (Pygo2)被发现与乙肝相关性肝纤维化相关，一项关于慢性乙型肝炎患者的研究，参与者行肝穿刺活检及弹性瞬时呈像检查，发现Pygo2与肝纤维化的相关性为0.952，曲线下面积为0.894，其诊断显著纤维化界值为77.43 ng/mL，并且Pygo2联合弹性瞬时呈像诊断肝纤维化的曲线下面积为0.912，敏感性和特异性分别为87.90%、85.20%，高于HA、CIV、LN [35] 。

血清可溶性甘露糖受体(sMR) [36] 、T淋巴细胞免疫球蛋白黏白蛋白分子3 [37] (Tim 3)、DNA甲基转移酶1 (DNMT1)与乙肝肝纤维化正相关。非编码RNA (ncRNAs)有干扰信号转导、调节靶基因等作用，ncRNAs通过调节肝星状细胞激活和增殖促进纤维化，cicr-RNA与肝纤维化呈负相关 [38] 。miR-30a、miR-29c [39] 与慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化呈负相关，可辅助诊断肝纤维化。

3. 小结与展望

肝纤维化需结合病因，联合血清学、影像学及病理学综合评估判断，肝穿刺活检是肝纤维化诊断的金标准，但其临床应用受限。血清学标志物具有创伤小、操作方便、可动态随访观察、患者接受度高等优点，对于纤维化的诊断及预测有重要价值，能减少肝脏穿刺活检，可以对肝病的诊断及治疗提供一些临床依据，但目前尚缺乏统一标准，联合检测可提高其诊断价值，未来需要大样本的研究进一步评估其临床诊断价值，获得灵敏度及特异更好的生物学标志物。

NOTES

^*通讯作者。