1. 引言
甘肃民勤地处石羊河流域下游，西、北、东三面被腾格里沙漠和巴丹吉林沙漠包围，是中国西北风沙线上的“桥头堡”，前国务院总理温家宝曾12次批示“决不能让民勤成为第二个罗布泊”，习近平总书记指示“确保不让民勤成为第二个罗布泊”，可见该地区生态环境治理工作的重要性和迫切性。在历史上，民勤地区曾是植被茂密 [1] ，建国以来，石羊河上游农业生产规模不断扩大，流入下游绿洲区内的水量急剧减少 [2] ，下游地区为了维持原有的生产规模，不得不过量开采地下水来满足灌溉需水 [3] ，导致天然植被死亡、尾闾湖沼干涸、盐碱化和沙漠入侵等，造成土地大面积弃耕而撂荒 [4] 。再加上近年来政府“关井压田”和退耕政策，使退耕区的面积又有所增加 [5] 。这部分退耕区次生草地是草原向荒漠过渡的一类十分脆弱的旱生化草原生态系统 [6] ，如果不及时保护，易形成恶性循环，使次生草地土壤生态系统遭到破环 [7] [8] 。因此，如何保护与合理利用石羊河流域下游绿洲退耕区次生草地，促进该地区生态环境的保护、修复和改善是亟待解决的新课题。
次生草地的演化不仅仅是地表植被的演替，更与土壤的变化尤其是土壤微生态的变化具有密切联系 [9] 。植被演替是次生草地土壤性质变化的直接原因，而土壤性质的变化也必然引起植被退化，二者互为因果 [10] 。侯扶江和南志标等认为草地演化退化不仅是地表植被和土壤的变化，也是这2个子系统耦合关系的丧失和系统相悖所引起的 [11] 。
在植被演替和土壤变化的过程中，土壤微生物是最敏感、最活跃的成分 [9] ，土壤微生物多样性是土壤系统功能的重要特征及度量生态系统功能恢复与维持的关键指标 [12] ，也是植物与土壤间联系的载体，能敏感的指示土壤理化性状的变化，其高低直接影响着土壤生产力，可用来准确及时的反映土壤质量，关乎生态系统结构和功能的稳定性 [13] [14] 。所以，保护与合理利用退耕区次生草地，不但要了解植被生长状况和土壤理化特性，还必须在系统研究不同年代退耕区次生草地土壤微生物多样性的基础上，特别研究其功能菌群的变化规律，才能制定出相应的管理方案与对策。
本项目在该地区选取地域相近、成土母质相同、气候水分等环境条件相同或相近，但退耕年限不同的次生草地为演变序列样地作为研究对象，利用多种现代生物技术，从结构多样性、遗传多样性以及功能多样性三个层面进行综合研究，在此基础上，研究其功能菌群的变化规律，为次生草地的保护、合理利用及生态环境的保护、修复、改善提供理论依据。
2. 项目研究方法
2.1. 项目研究内容
1) 民勤绿洲不同年代退耕区次生草地植被群落及物种多样性特征：选取地域相近、成土母质相同、气候水分等环境条件相同或相近，但退耕年限不同(1a、2a、4a、8a、13a、20a、30a及40a)的次生草地为演变序列样地作为研究对象，调查样方内植物的种类、高度、冠幅、个体数以及调查样地的地理位置、海拔高度等，采用重要值、Margalef丰富度指数、Simpson和Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数对不同年代退耕区次生草地植被群落特征及物种多样性进行分析。
2) 民勤绿洲不同年代退耕区次生草地土壤理化、微生物数量、微生物生物量及土壤酶活性特征：调查民勤绿洲不同年代退耕区次生草地土壤理化性质和土壤水分及土壤微生物和酶活性，了解退耕区次生草地土壤特性变化规律，以及植被与土壤因子之间的相关性和内在联系。
3) 民勤绿洲不同年代退耕区次生草地土壤微生物多样性及变化规律以及土壤微生物与植被、环境因子间的互作机理：对民勤绿洲不同年代退耕区次生草地土壤微生物结构多样性、功能多样性和遗传多样性进行系统测定和分析，结合地域特征、气象资料、水文资料解读退耕区次生草地土壤微生物多样性及其变化规律，探讨土壤微生物功能菌群在次生草地演变过程中所起的作用及其驱动机制。
2.2. 项目实施方法
1) 样地布设与植被调查：2017年10月，走访调查当地农户和查阅西渠镇煌辉村与志云村退耕土地使用记录采用空间替代时间的方法，集中连片的退耕地上，选择植物生长均匀、微地形差异较小，并且土壤没有因自然因素而导致地形的变迁或因人为因素而引起的土壤物质再分配的地段，分别选择退耕年限为1a、2a、4a、8a、13a、20a、30a及40a和未开垦的荒漠草地作为对照设置100 m × 100 m的9个典型样地，用GPS定位，样地面积为1 hm2 (100 m × 100 m)，每个样地内选5个10 m × 10 m的样方(调查植被)，调查样方内植物的种类、高度、冠幅、个体数以及调查样地的地理位置、海拔高度等，并在每个样地中以S形方法布设5个土样采集点，做好标记。
2) 土壤样品的采集：2018年9月19~20日，在每个样地内布设的5个土样采集点，挖土壤剖面，分0~20 cm和20~40 cm两层采集土壤样品，将同一样地同一土层的3个土样混合均匀后，用四分法将土样分两份，一份装入无菌袋中封存，做好标记，并放入装用有冰块的保温箱中带回实验室，去除植物根系和杂物，将土样随机分成3份，分别置于室温、4℃、−20℃及−80℃ (冷冻干燥后)，用于土壤微生物和酶活性的测定和土壤总基因组DNA提取及高通量测序分析。另1份风干后用于土壤理化性质测定。
3) 植被重要值及物种多样性计算方法。
计算灌木层和草本层各植物种重要值，计算公式如下 [15] ：
(1)
式中：IV表示重要值；RHI表示相对高度；RCO表示相对盖度；RFE表示相对频度。
相对高度 = (某种植物的高度/全部植物的总高度) × 100%
相对盖度 = (某种植物的盖度/全部植物的总盖度) × 100%
相对频度 = (某种植物的频度/所有种的总频度) × 100%
选择Shannon多样性指数、Simpson优势度指数、Pielou均匀度指数、Margalef丰富度指数等对植物群落进行多样性测量计算。计算公式分别为 [15] ：
Shannon多样性指数：
(2)
Simpson优势度指数：
(3)
Pielou均匀度指数：
(4)
Margalef丰富度指数：
(5)
Pi是频度，Ni是第i个物种的个体数，S是物种数量，N是所有物种的总个体数。
4) 土壤测定方法。
A. 土壤物理性质的测定
土壤水分：恒温箱烘干法；土壤容重：环刀法；土壤机械组成：马尔文2000激光粒度仪测定；土壤pH值：用pH仪(PHS-3S)测定。
B. 土壤化学性质的测定
土壤有机碳采用重铬酸钾氧化外加热法；土壤全氮采用凯氏蒸馏法；速效钾采用原子吸收分光光度法；土壤速效磷采用氢氧化钠溶液–钼锑抗比色法；土壤土壤有机质：重铬酸钾–硫酸外加热法。
C. 土壤酶的测定
脲酶活性采用靛酚蓝比色法；磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法；蔗糖酶性采用3,5-二硝基水杨酸比色法；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法。
D. 土壤微生物量的测定：土壤微生物量采用氯仿熏蒸培养法测定 [9] 。
土壤微生物量碳(SMBC)：采用K2Cr2O7-H2SO4外加热法测定。
计算公式为：
(6)
土壤微生物量氮(SMBN)：采用凯氏定氮法测定。
计算公式为：
(7)
土壤微生物量磷(SMBP)：采用钼蓝比色法测定。
计算公式为：
(8)
式中：Ec、En和Ep为熏蒸土壤提取液中有机碳、全氮和磷含量，Ec0、En0和Ep0未熏蒸土壤提取液中有机碳、全氮和磷含量，kEc、kEn和kEp为校正系数，分别是0.38、0.54和0.40。
E. 土壤微生物多样性测定
土壤总DNA提取：使用Fast DNA® Spin Kit for Soil试剂盒，根据产品操作手册提取样品基因组DNA。完成基因组DNA抽提后，利用NanoDrop2000检测DNA纯度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。基因组DNA样品用干冰保藏后立即送往上海美吉生物科技有限公司进行测序分析。
宏基因组测序：采用Quanti Fluor TM-ST蓝色荧光定量系统，对回收产物进行定量检测。然后构建插入片段为300 bp的Paired-End(PE)文库，经过Qubit定量和文库检测合格后，进行高通量测序，测序平台为Miseq。
测序序列统计与质控：应用统计学的方法，对所测序列进行统计和质控，可以从宏观上直观地反映出样本的文库构建质量和测序质量。
测序数据拼接组装：主要有多重混合拼接(Multiple_Megahit或Multiple_IDBA_UD)：利用IDBA-UD最大化利用测序数据，进行多重混合拼接组装。单拼Megahit：利用Megahit软件针对不同测序深度序列进行组装。单拼SOAPdenovo2：利用软件SOAPdenovo2，使用Meta Gene对拼接结果中的contigs进行ORF预测。选择核酸长度大于等于100 bp的基因，并将其翻译为氨基酸序列，获得各样本的基因预测结果统计表。环境中所有基因的整体信息可以通过构建一个非冗余基因集用CD-HIT软件进行聚类(默认参数为：95% identity、90% coverage)，每个类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集，从而可以探究不同样本之间的共性和差异。
物种注释：使用BLASTP将非冗余基因集与NR数据库进行比对(BLAST比对参数设置期望值e-value为1e-5)。
5) 数据处理：试验数据经Excel 2013整理，再利用目前国际上通用软件AMOS、DPS、ENVI-IDL、SAS、NeuroSolutions进行数据分析。
3. 项目成果
依托本项目总计发表科研论文14篇，其中SCI论文2篇，中文核心期刊10篇；申报国家专利10项，其中发明专利2项，均已授权。此外，项目组主要成员获甘肃省林草局科技奖励1项，协助培养博士研究生与硕士研究生各1名，项目的执行达到了申请时的预期目标。
本项目以民勤绿洲不同年代退耕区次生草地土壤微生物为研究对象，采用时空替代法和现代分子生物学测序技术，开展退耕区次生草地土壤微生物的结构多样性、功能多样性和遗传多样性系统分析。主要结论如下：
1) 研究区出现植物种39种，隶属15科32属，其中灌木植物8种，多年生草本15种，一年生草本16 种，因受自然环境条件的影响，物种组成较为简单，很多种为单科单属。
2) 细菌是研究区土壤中的主要微生物类群，其次是放线菌，真菌最少；土壤微生物数量随退耕年限的延长，细菌及放线菌所占比例不同程度的减少，真菌变化规律不明显；土壤微生物量随土层深度的加深而逐渐降低，表聚现象明显；磷酸酶、蔗糖酶和脲酶活性表聚现象明显，且表现为退耕初期(0a-8a)显著高于退耕末期(13a-40a)。
3) 研究区次生草地土壤微生物数量、微生物量和土壤酶活性之间均存在不同程度的相关性，三者之间联系较密切，互相作用影响。
4) 研究区微生物群落门水平的优势微生物群落以Actinobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi等为主，属水平以Gemmatimonas、Chloroflexi、Acidobacteria为主。
5) 研究区微生物群落宏基因组在不同功能类别水平上的功能组成(KEGG level-3)以Carbonm etabolism、Biosynthesis of amino acids、ABC transporters为主。
6) 通过退耕地聚类谱系图可以推断出民勤绿洲退耕地土壤系统演变过程中，退耕4a、8a及20a分别是土壤质量发生重大变化的节点，退耕4a左右是民勤绿洲退耕地恢复治理的关键时期。本项目的实施能够为开发微生物资源和保护荒漠绿洲退耕区次生草地及生态系统修复提供理论依据。
4. 主要科技创新
1) 本研究区域特色明显，研究样地序列丰富(在相同或者相似条件下，有退耕1年到50多年的研究序列样地)，为本项目提供了理想的对比研究场所。
2) 所解决的问题是国家生态建设项目石羊河流域综合治理工程和干旱地区植被建设急需解决的科学理论问题，研究成果具有重要的理论和实践指导意义。
3) 本项目首次从“土壤–植被–微生物”的角度，应用现代分子生物学技术，对民勤绿洲退耕区次生草地土壤微生物多样性(结构多样性、遗传多样性和功能多样性)进行对比研究，并结合植被、土壤理化特性、土壤酶等相关指标及甘肃民勤荒漠草地生态系统国家野外科学观测研究站积累50多年的气象和水文等资料，系统研究土壤微生物与植被、土壤以及其它因子间的相关性，揭示了退耕区次生草地演变过程中土壤微生物变化规律及其主要驱动因素。
5. 成果推广应用
本项目根据民勤绿洲退耕区次生草地自然环境和地理条件，结合民勤绿洲退耕区次生草地演变过程中土壤微生物多样性特点及其变化规律，优化现有的生态修复技术和措施，在促进本地区生态环境修复的过程中，结合农户劳动资源，形成“土地–农户–产出”三方结合的生产体系。应用不同的人工配置模式促进退耕区次生草地植被恢复，改善地力条件，调控绿洲生态系统协调发展，有效防治退耕区次生草地的沙漠化和盐碱化，改善当地生态环境。为民勤绿洲边缘及同类地区退耕区次生草地的生态系统恢复和合理利用提供示范，形成干旱内陆河流域退耕区次生草地生态经济修复技术体系 [16] 。改变当地农业产业结构，形成新的经济增长点，增加农民收入；通过示范区的建设，起到带动和推广作用，促进区域经济和民生事业的发展。不光对民勤绿洲边缘退耕区次生草地具有重要的意义，也对干旱区退耕地的治理具有重要的作用和广阔的应用前景，可以有效缓解环境压力，实现大地增绿、产业增效、农民增收、经济增涨的共赢目标。
6. 结语
本项目采用时空替代的方法，应用现代分子生物学技术，从微生态学入手，开展了民勤绿洲退耕区次生草地土壤微生物多样性及其功能菌群的研究，通过对民勤绿洲不同年限退耕区次生草地土壤微生物多样性指标在垂直及不同退耕年限尺度进行测定，系统解析退耕区次生地植被演替过程中土壤微生物多样性的变化，进一步耦合分析土壤理化性质、传统微生物指标、分子微生物指标之间的联系，阐明了民勤绿洲退耕区次生草地土壤微生物多样性的动态变化规律、过程，揭示了次生草地土壤微生物功能菌群的作用，对开发其中的微生物资源和保护退耕区次生草地具有重要的意义，为研究民勤绿洲及其相似地区次生草地修复与生态环境的治理提供科学理论依据。
基金项目
国家自然科学基金项目(31760709, 32360329)；甘肃省重点研发计划(21YF5FA038)；甘肃省自然科学基金(21JR7RA732)。