STAT4基因多态性与慢性乙型肝炎患者细胞因子分泌水平的相关性研究

The Correlation Study between STAT4 Gene Polymorphism and Cytokine Secretion Levels in Patients with Chronic Hepatitis B

摘要: 目的：通过检测慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B virus, CHB)患者信号转导与转录激活因子4 (signal transducer and activator of transcription 4, STAT4)基因的rs7574865位点突变情况，探究CHB患者STAT4表达与细胞因子分泌水平的相关性。方法：收集昆明市第三人民医院2020年8月至2022年8月确诊的300例CHB患者和300例健康体检者为研究对象。采用实时荧光定量PCR技术检测两组STAT4 rs7574865位点的基因多态性。采用酶联免疫吸附法检测CHB患者外周血清IL-21、IL-35、IL-37和TGF-β水平。结果：CHB患者组STAT4基因rs7574865位点的GT、GG基因型高于对照组(P < 0.01)，G等位基因频率显著高于对照组(P < 0.01)。GT型CHB患者IL-21及IL-35水平明显高于TT及GG型(P < 0.05)。结论：STAT4基因多态性与CHB的发生存在一定相关性，GT型患者IL-21、IL-35水平明显升高，临床可通过检测CHB患者STAT4基因多态性及IL-21、IL-35水平评估CHB发生的风险性。

Abstract: Objective: To detect the rs7574865 mutation of signal transducer and activator of transcription 4 (STAT4) gene in patients with chronic hepatitis B (CHB), and explore the correlation between STAT4 expression and cytokine secretion level in CHB patients. Method: A total of 300 CHB patients and 300 healthy individuals diagnosed from August 2020 to August 2022 at Kunming Third Peo-ple’s Hospital were collected as research subjects. Real time fluorescence quantitative PCR technol-ogy was used to detect gene polymorphism at the STAT4 rs7574865 locus in two groups. The IL-21, IL-35, IL-37 and TGF-β in peripheral blood of CHB patients were detected by enzyme-linked im-munosorbent assay. Results: The GT and GG genotypes at rs7574865 of STAT4 gene in patients with CHB were higher than those in the control group (P < 0.01), and the frequency of G allele frequency was significantly higher than that in the control group (P < 0.01). The levels of IL-21 and IL-35 in GT type CHB patients were significantly higher than those in TT and GG types (P < 0.05). Conclusion: There is a certain correlation between STAT4 gene polymorphism and the occurrence of CHB. The levels of IL-21 and IL-35 are significantly increased in GT type patients. Clinical evaluation of the risk of CHB can be achieved by detecting STAT4 gene polymorphism and IL-21 and IL-35 levels in CHB patients.

1. 引言

乙型病毒性肝炎(hepatitis B virus, CHB)是由乙型肝炎病毒(chronic hepatitis B virus, HBV)引起的一种世界性疾病。据统计，全球每年超过100万人死于病毒性肝炎，其感染人数是艾滋病人数的10倍以上。我国是病毒性肝炎高度流行区域，近20年来，其死亡率一直位居我国法定传染病报告的前列，我国也成为了世界上为此所付出社会成本最多的国家 [1] [2] 。因此，病毒性肝炎的防治一直是我国医疗卫生管理部门重点关注的问题。我国病毒性肝炎感染人群中，CHB感染者基数尤其巨大。感染乙肝病毒的患者极易转为慢性感染，并进一步进展为肝硬化、肝癌等疾病，危害人体健康。目前，我国CHB死亡数仍占病毒性肝炎的70%以上，远高于其他型病毒性肝炎 [3] [4] 。中国疾控中心数据显示，2008~2017年云南省昆明市西山区血源及性传播疾病以CHB为首，年均发病率69.03%/10万，报告4985例，占血源及性传播疾病发病总数的46.41%，占乙类传染病报告总数的30.02%，占病毒性肝炎报告总数的60.29%，截至2022年2月，云南省共报告法定传染病15,912例，其中共报告16种乙类传染病，病毒性肝炎的报告发病数居第2位，作为CHB患者高发省份，需积极探索有助于CHB诊疗的手段，提高CHB患者的生活质量 [5] [6] 。CHB患者肝脏受到损伤时，会导致以胶原蛋白为主的细胞外基质的合成与降解失衡。该过程是一系列细胞信号转导通路和网络共同控制的结果，其中酪氨酸蛋白激酶–信号传导和转录激活因子(Janus Kinase-Signal Transducers and Activators of Transcription, JAK-STAT)信号通路在这个过程中发挥着重要的作用 [7] 。多项研究表明，STAT4基因rs7574865位点的多态性与肝损伤(CHB)的发生有一定的关联性。本研究探讨CHB与STAT4 rs7574865基因多态性的相关性，以期对于具有STAT基因易感性的CHB患者提供早期干预与延缓病情发展具有指导意义。

2. 材料与方法

1) 研究对象收集昆明市第三人民医院2020年8月至2022年8月确诊的300例CHB患者为研究对象；选取同期本院300例健康体检者为对照组。本研究已通过昆明市第三人民医院伦理委员会批准。所有患者均来自同一地区，均签署知情同意书。

2) 诊断标准参照《慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)》 [8] 中有关CHB的诊断标准。

3) 纳入及排除标准：纳入标准：a) 年龄16~60岁，HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者：血清乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)阳性、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)阳性、HBV DNA阳性，ALT持续或反复升高，或有肝组织学病变；HBeAg阴性慢性乙型肝炎：血清HBsAg阳性，HBeAg阴性，HBV DNA阳性，ALT持续或反复升高，或有肝组织学病变。b) 慢性HBV携带者：血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA阳性者，1年内连续随访3次以上均显示血清ALT和AST在正常范围，肝组织学检查无明显异常。c) HBsAg阳性肝硬化患者。d) HBsAg阳性肝癌患者。e) 签署知情同意书。对照组的筛选标准：a) 乙肝疫苗未接种。b) 感染指标(HBsAb、HBcAb、HBeAb、HBeAg、HBsAg)是阴性。血生化和血常规正常。排除标准：a) 艾滋病或非乙肝病人。b) 乙肝两对半不明确。c) 疫苗接种者只有HBsAb (+)。d) 其他肝病：例如个体免疫性肝病，毒性传染导致的肝病等。e) 重症系统免疫性疾病如系统性红斑狼疮等。f) 非云南省汉族人。

4) 样品基因多态性检测采用实时荧光定量PCR技术检测STAT4rs7574865基因多态性。正向引物序列：5’-GACTTACGGGTCATTTAGGC-3’；反向序列：5’-TAACAGGGATGGTTCAATAA-3’ PCR反应条件：96℃预变性5 min，95℃变性45 s，51℃退火55 s，72℃延伸90 s，共32个循环。酶切反应体系为25 μl，其中包括10 μl PCR产物、1 μl HpaI内切酶、2 μl酶切反应缓冲液、双蒸水12 μl；37℃酶切12 h。酶切产物通过2%琼脂糖凝胶进行基因型分型。

5) ELISA方法检测细胞因子IL-21、IL-35、IL-37、TGF-β在空腹条件下抽取4 mL静脉血液，抽取后立即行血清分离，于−20℃条件下保存待检。采用ELISA法检测对照组及CHB患者血清细胞因子IL-21、IL-35、IL-37、TGF-β水平，试剂盒购自青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司，严格按照说明书进行操作。

6) 统计学方法用SPSS 17.0软件进行统计分析。对研究对象的基因型及等位基因分布频率进行Hardy-Weinberg平衡检验。正态分布的计量资料以 $\bar{x}\pm s$ 表示，方差齐数据的两组间比较用独立样本t检验；多组间比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验；计数资料以率表示，采用χ²检验；基因型与生物化学指标间的关系采用Logistic回归分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. CHB患者组和对照组STAT4基因多态位点、等位基因分布情况及相关性分析

经测序STAT4 rs7574865有TT、GT、GG 3种基因型。CHB患者组和健康对照组的STAT4基因rs7574865位点的基因型及等位基因的检测结果见表1。在患者组和对照组中的rs7574865的基因型及等位基因频率分布经卡方检验，均符合Hardy-Weinberg平衡(P > 0.05)，这表明所研究的群体具有代表意义。表1中的结果表明CHB患者rs7574865位点的GT、GG基因型高于对照组(P < 0.01)，G等位基因频率均显著高于对照组(P < 0.01)，分析结果表明该位点的多态性与CHB的发生存在显著的相关性。

Table 1. Genotype and allelic distribution and correlation of STAT4 gene rs7574865 locus in the CHB group and control group

表1. STAT4基因rs7574865位点在CHB组与对照组的基因型和等位基因分布及相关性

3.2. CHB患者组(TT、GT及GG基因型) IL-21、IL-35、IL-37、TGF-β水平比较

GT型CHB患者IL-21水平明显高于TT及GG型，差异有统计学意义(P < 0.05)；GT型CHB患者IL-35水平显著高于TT及GG型，差异有统计学意义(P < 0.05)；3种基因型患者的IL-37、TGF-β水平比较差异无统计学意义(P > 0.05)，见表2。

Table 2. Comparison of cytokine levels in CHB patients with TT, GT, and GG genotypes

表2. TT、GT及GG基因型CHB患者细胞因子水平比较

4. 讨论

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)是人类基因组变异的最常见形式，通过改变与转录因子、miRNA的结合数量或强度以及通过对mRNA的剪接等影响靶基因的表达水平。大量的流行病学研究显示SNP改变可以影响肿瘤形成、侵袭、转移以及预后等过程。在宿主遗传背景方面，SNP会影响个体对疾病的易感性和对药物治疗的反应，这已经在多种疾病中得到证实。特别在乙型肝炎，MHCI、MHC II、TNF-α甘露糖相关蛋白等基因的SNPs能影响宿主的免疫系统和抗病毒反应，从而影响疾病的进程(如耐受状态，感染慢性化等)和治疗反应。因此，对SNPs的研究可以发现预测慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗反应的重要因素，从而在预测患者可能无法获得良好应答的情况下，避免不必要的药物不良反应和节省医疗费用。信号传导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)是由Janus蛋白酪氨酸激酶(janus pro-tein tyrosine kinase, JAK)活化的一类转录因子在JAK-STAT信号通路中，信号传导与转录激活因子-4 (STAT4)已经被证实与肝损伤存在一定的相关性 [9] 。STAT4是STAT家族中的近年来发现的一类转录因子，可以调节白细胞介素以及控制辅助性T细胞1 (helper T cell 1, Th1)和辅助性T细胞17 (helper T cell 17, Th17)的活性影响炎症疾病的发生与发展 [10] 。STAT4基因位于人的染色体2q32.2-2q32.3；STAT4基因存在多个单核苷酸多态性位点，其中rs7574865位点可能通过影响基因的表达而发挥作用 [11] 。

现代医学研究表明HBV感染所引起的免疫损伤以细胞免疫为主，Th1、Th2、Th17及Treg细胞的水平异常，及Th1/Th2、Th17/Treg比值失衡，是免疫紊乱的关键环节 [12] 。Th17细胞是促进HBV感染患者肝脏炎症及纤维化发生的重要因素，Treg细胞则介导免疫耐受，主要抑制免疫反应，减轻免疫损伤，导致机体不能及时清除病毒，致HBV持续感染。Th17和Treg细胞比例失衡，可引起免疫应答异常，介导肝脏炎症反应，导致CHB发病和病情进展至肝硬化、肝癌 [13] 。IL-21是近年来新发现的，由Th17细胞分泌的促炎细胞因子。有学者研究报道CHB患者IL-21水平随着Th17细胞增多而升高，IL-21水平和Th17细胞频数与谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)、总胆红素(total bilirubin, TBIL)、直接胆红素(direct bilimbin, DBIL)水平呈正相关，提示IL-21和Th17细胞与肝损伤严重程度紧密相关 [14] 。IL-35是由Treg细胞分泌的新发现的抑炎细胞因子，具有抑制Th17细胞的增殖和分化的功能，进而减少IL-17和IL-22等促炎细胞因子的分泌 [15] [16] 。有研究发现在慢性HBV感染相关疾病中IL-35可能介导Treg细胞对免疫应答的负向调节作用，其通过抑制IL-17/IL-22的产生，减轻炎症反应，影响HBV DNA的清除，造成HBV慢性感染 [17] [18] 。由此可见，IL-21、IL-35参与了CHB疾病的发病过程，在HBV感染慢性化过程中发挥重要作用。IL-37作为一种新型细胞因子，是Toll样受体的配体和促炎因子的天然抑制剂 [19] ，其表达与免疫细胞和炎症反应密切相关。实验证明在CHB患者中IL-37水平呈现高表达，同时发现IL-37可能参与HBeAg血清学转化。TGF-β主要包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，在调控免疫系统和抗病毒感染中发挥双重作用。一方面，TGF-β可以增强Treg活性介导抗炎作用；另一方面，TGF-β促进Th17分化并分泌促炎因子。许多证据表明HBV感染能够提高TGF-β的表达，促进细胞外基质沉积，进而破坏肝脏结构引起肝损伤。但也有研究 [20] 表明，TGF-β通过激活脱氨基反应诱导病毒cccDNA的降解。

本研究结果显示，CHB患者组STAT4基因rs7574865位点的GT、GG基因型高于对照组，G等位基因频率显著高于对照组。GT型CHB患者IL-21及IL-35水平明显高于TT及GG型。综上STAT4基因多态性与CHB的发生存在一定相关性，且GT型患者IL-21、IL-35水平明显升高，可能基因型与细胞因子分泌有关，但其具体机制仍需进一步研究。

基金项目

云南省科技厅基金项目(202001BA070001-092)；云南省科技人才和平台计划——云南省孔令义专家工作站(2019IC047)。

NOTES

^*通讯作者。