摘要: 目的：探讨长链非编码RNA BANCR表达及TSHR甲基化与BRAFV600E突变的甲状腺乳头状癌的关系。方法：收集60例BRAFV600E突变的甲状腺乳头状癌(PTC)患者癌组织样本60例和癌旁正常甲状腺组织样本60例(简称癌旁组织)，上述所有PTC患者已采用荧光定量PCR (QPCR)检测分析上述各样本BANCR基因的表达水平，并应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-Specific Polymerase chain reac-tion, MSP)法检测上述各样本中TSHR基因启动子甲基化情况，并分析上述癌组织和癌旁组织中各样本基因表达水平和TSHR甲基化情况与BRAFV600E突变的PTC患者的临床病理特征之间的关系。结果：癌组织组：BANCR相对表达量为(1.55 ± 1.62)，高表达率为66.67%，癌旁组织组分别为(0.74 ± 0.63和30%)，癌组织显著高于癌旁组织(P < 0.05)。癌组织中，BANCR高表达与肿瘤的颈部淋巴结转移存在显著相关性(P < 0.05)。癌组织组中TSHR甲基化的发生率为93.3% (56/60)，癌旁组织组中TSHR甲基化的发生率为18.3% (11/60)，TSHR甲基化PTC患者例数显著高于非甲基化PTC患者，差异均具有统计学意义(P均 < 0.01)。癌组织中BANCR的表达水平及TSHR甲基化以及两者联合检测阳性例数均显著高于癌旁组织，差异具有统计学差异(P均 < 0.05)，BANCR高表达联合TSHR甲基化对BRAFV600E突变的PTC诊断的灵敏度、特异性和准确性较单项检测均出现上升趋势，但仅灵敏度与单一检测相比差异具有统计学意义(P < 0.05)。结论：BANCR高表达和TSHR甲基化均与BRAFV600E突变的PTC患者颈部淋巴结转移密切相关，与肿瘤的进展相关并提示不良预后。且BANCR高表达联合TSHR甲基化对BRAFV600E突变的PTC临床诊断具有较佳的灵敏度。
Abstract:
Objective: To investigate the relationship between long non-coding RNA BANCR expression and TSHR methylation and BRAFV600E-mutated papillary thyroid carcinoma (PTC). Methods: Collecting 60 cancer tissue samples and 60 adjacent normal thyroid tissue samples (adjacent tissue) from 60 patients with BRAFV600E mutation in PTC, the expression levels of BANCR genes were analyzed for each of the above samples by fluorescence quantitative PCR (QPCR), and applied the methyla-tion-specific polymerase chain reaction (MSP) for promoter methylation of the TSHR gene in these samples, and analyzed the relationship between gene expression levels and TSHR methylation of each sample in both cancerous and adjacent tissues and the clinicopathological characteristics of patients with PTC with BRAFV600E mutations. Results: The cancer tissue group: the relative expression level of BANCR was (1.55 ± 1.62), the high expression rate was 66.67%, and the adjacent tissue group was (0.74 ± 0.63 and 30%, respectively), and the cancer tissue was significantly higher than the adjacent tissue (P < 0.05). There is significant correlation between high BANCR expression and cervical lymph node metastasis in cancer tissues (P < 0.05). The incidence of TSHR methylation was 93.3% (56/60) in the cancer tissue group and 18.3% (11/60) in the paracancer tissue group, the number of TSHR methylated PTC patients was significantly higher than non-methylated PTC patients, and the differences were statistically significant (P < 0.01). The expression level of BANCR, TSHR methylation and the number of positive cases were significantly higher than that of carcinoma tissue and statistically different (P < 0.05). The sensitivity, specificity and accuracy of BANCR high expression combined with TSHR methylation for PTC diagnosis of BRAFV600E mutation showed an increasing trend compared with individual detection, but the sensitivity was statistically different compared with the single test (P < 0.05). Conclusion: High BANCR expression and TSHR methylation are closely related with cervical lymph node metastasis in PTC patients with BRAFV600E mutation, which is associated with tumor progression and indicates poor prognosis. Moreover, high expression of BANCR combined with TSHR methylation has better sensitivity for clinical diagnosis of PTC with BRAFV600E mutation.
1. 引言
PTC是甲状腺癌中最常见的病理组织学亚型，占85%~90%，发病率也有在逐年上升 [1] 。PTC的治疗以手术和碘131治疗为主，甲状腺激素抵抗或碘131治疗无效是复发、转移的主要因素，也是增加死亡率的重要因素 [2] [3] [4] 。因此，寻找影响PTC转移及预后的分子标志物，能够为PTC的诊断和治疗提供新思路。
长链非编码RNA-BANCR (BRAF-activated long noncoding RNA, LncRNA BANCR)由BRAF突变激活，研究发现BANCR基因在不同的恶性肿瘤中有特异性的表达和功能，其在甲状腺癌中主要作为致癌基因，它通过改变细胞增殖、迁移来影响肿瘤的发生 [5] [6] [7] 。同时我们还发现多个基因启动子超甲基化在甲状腺癌中起重要作用，其中最突出的是促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)基因启动子甲基化，特别是与BRAF基因改变状态密切相关。因此，本研究的目的是在一系列PTC恶性组织BRAFV600E基因突变状态的背景下，分析LncRNA BANCR表达及TSHR基因启动子的高甲基化与PTC的关系。
2. 材料和方法
2.1. 材料
PTC癌组织和癌旁组织标本均为新鲜样本，选自2022年1月~2022年12月在齐齐哈尔市第一医院甲状腺外科经手术病理和基因检测证实为PTC并伴有BRAFV600E突变的患者60例，并分为癌组织组60例，癌旁组织组60例。60例患者中男16例，女44例；年龄18~69岁，平均(50.81 ± 7.61)岁；侵及被膜51例，无侵及9例；淋巴结转移49例，无转移11例；肿瘤直径 ≤ 1 cm 26例，>1 cm 34例；单发病灶22例，多发病灶38例。术前未接受放化疗等治疗。
2.2. 方法
2.2.1. 荧光定量
PCR (quantitative real-time PCR, QPCR)检测采用TRIzol试剂提取PTC组织和细胞总RNA，通过逆转录梅逆转录成cDNA (complementary DNA)后，制备标准曲线样品，标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBead热启动聚合酶来自Promega公司)，进行RealTime PCR扩增和检测。结果采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，相对表达量 > 0.01为高表达。
2.2.2. 甲基化特异性
PCR (Methylation specific PCR, MSP)法检测TSHR甲基化 [8] ，采用MSP法检测PTC癌组织及癌旁组织中TSHR甲基化情况。采用DNA亚硫酸氢盐处理试剂盒(购自ZYMO RESEARCH，型号D5006)对癌组织及癌旁组织样本中提取的DNA进行修饰，将其作为模板，在PCR仪(厂家：赛默飞世尔科技公司Thermo Fisher，型号：TCA4848)中利用甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增，根据试剂盒说明进行设置和操作，然后通过凝胶成像仪和电泳仪进行鉴定。
2.3. 统计学方法
采用SPSS26.0统计学软件对本研究的计量数据和计数数据进行分析。数据以平均数 ± 标准差、率(%)等进行表示，采用卡方检验对计数数据进行分析，采用t检验对计量数据进行分析，P ≤ 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. TSHR甲基化程度和BANCR表达水平在BRAFV600E突变的PTC癌组织和癌旁组织中比较
通过QPCR实验及MSP法在60例成对BRAFV600E突变的PTC癌组织和癌旁组织中检测TSHR甲基化情况及BANCR的表达水平，癌组织TSHR甲基化率93.30% (56/60)，癌旁组织35% (21/60)，TSHR甲基化BRAFV600E突变的PTC患者例数显著高于非甲基化BRAFV600E突变的PTC患者，差异均具有统计学意义(P均 < 0.01)。癌组织BANCR相对表达量为(1.55 ± 1.62)，高表达率为66.67% (40/60)，癌旁组织BANCR相对表达量(0.74 ± 0.63)，高表达率30% (18/60)，相比于对应的癌旁组织，PTC癌组织内BANCR表达上调明显，差异有统计学意义(t = 2.192, P < 0.05, X2 = 16.151, P < 0.001)，癌组织中TSHR甲基化和BANCR的表达水平以及两者结合分别检测出的阳性例数均显著高于癌旁组织，差异具有统计学差异(P均 < 0.001)，见表1。
Table 1. Comparison of methylation and high expression levels of TSHR and BANCR in cancer tissues (example, %)
表1. 各组TSHR和BANCR在癌组织中甲基化程度与高表达水平比较(例，%)
3.2. TSHR甲基化和BANCR高表达与患者主要临床病理特征的关系
BRAFV600E突变的PTC肿瘤组织内BANCR表达水平与性别、侵及被膜、多灶癌、肿瘤直径 > 1 cm无显著性差异，本研究中，颈部淋巴结转移BRAFV600E突变的PTC患者BANCR高表达例数显著高于低表达PTC患者。本研究认为，癌组织中TSHR基因分别在侵及被膜、多灶癌、淋巴结转移中表现出显著的高甲基化(P均 < 0.05)，而在不同性别、肿瘤直径 > 1 cm组间甲基化率差异无统计学意义，见表2。
Table 2. Correlation analysis of high BANCR expression and TSHR methylation and major clinicopathological factors of patients (example, %)
表2. BANCR高表达和TSHR甲基化与患者主要临床病理因素的相关性分析(例，%)
3.3. 两项指标对PTC诊断的特异性、灵敏度和准确性比较分析
TSHR甲基化联合BANCR高表达对BRAFV600E突变的PTC诊断的特异性和准确性与单项检测数据相比均表现升高趋势，但差异无统计学意义(P < 0.05)，而TSHR甲基化联合BANCR高表达可明显提高BRAFV600E突变的PTC诊断的灵敏度，差异具有统计学意义(P < 0.05)，见表3。
Table 3. Comparative analysis of specificity, sensitivity and accuracy of two indicators/%
表3. 两项指标对PTC诊断的特异性、灵敏度和准确性比较分析/%
4. 讨论
甲状腺癌的发病率居内分泌系统恶性肿瘤之首，我国的甲状腺癌的发病率也呈上升的趋势，甲状腺癌的5年存活率为67.5% [9] 。虽然高分化PTC预后较好，但复发和淋巴结转移的情况不可忽视，因此其早期诊断对癌症的治疗及生存率的提升至关重要 [10] [11] [12] 。鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B (BRAF)基因突变在甲状腺乳头癌患者中最常见，50%~60%的PTC患者中存在BRAFV600E突变，并且在其他类型的甲状腺癌如未分化癌中也发现BRAFV600E突变 [13] 。研究 [14] [15] [16] 提示，PTC甚至PTMC出现较高的复发风险与BRAFV600E基因突变密切相关，而且与患者复发后的摄碘能力下降相关，导致术后I131放射治疗效果不佳，BRAFV600E基因突变参与PTC的发生发展，且影响肿瘤的浸润、转移和复发。但仅通过BRAFV600E突变基因评判甲状腺肿瘤性质及PTC预后还存在一些不足，因此我们将研究BRAFV600E突变的PTC患者，结合其他基因改变情况是否可以进一步提高BRAFV600E突变PTC术前诊断和预后预测的特异性、灵敏度和准确性。
我们发现术前基因检测有助于甲状腺癌的早期诊治，但目前尚缺乏用于甲状腺癌检测的理想遗传基因标记物。近年来，lncRNA作为甲状腺癌发病机制中的新兴分子，研究发现长链非编码RNA-BANCR在不同的恶性肿瘤中有特异性的表达和功能，它通过改变细胞增殖、迁移来影响肿瘤的发生，为诊断和预后预测提供了新的思路，其作为新的分子治疗靶点，有望为PTC的全面治疗提供更好的方案。
另一热点研究是基因甲基化，它是一种表观遗传修饰，DNA高甲基化可引起染色体结构改变，不能与转录因子结合，进而导致基因失活。正常组织的肿瘤抑制基因不发生甲基化，当抑癌基因发生甲基化后，就不能正常转录、翻译合成抑癌蛋白及发挥抑癌作用，细胞就有可能发生单克隆增生形成肿瘤。TSHR基因是甲状腺特异性基因，也是甲状腺癌的抑制基因，BRAF基因突变与TSHR的表达密切相关，TSHR的高甲基化是PTC发生、发展的关键因素。
已有研究示：患者病理为多发癌灶、肿瘤最大径 > 1 cm及年龄小于45岁与PTC淋巴结转移情况密切相关 [17] [18] ，另有研究提示：导致甲状腺癌转移及进展的机制可能与PTC癌组织中TSHR基因启动子区频繁发生甲基化相关 [19] [20] 。结合以上研究情况，我们课题组选择60例BRAFV600E突变的PTC患者的癌组织及癌旁组织样本，采用QPCR和MSP法分别检测患者BRAFV600E突变的PTC癌组织及癌旁组织中TSHR甲基化程度和BANCR表达水平，并进一步对TSHR甲基化和BANCR表达的两项指标在PTC中的诊断价值及临床意义进行讨论分析，希望其对我们今后的PTC相关研究提供实验依据。
本课题结果显示在60例成对BRAFV600E突变的PTC癌组织和癌旁组织中检测BANCR的表达水平及TSHR甲基化情况，相比于对应的癌旁组织，PTC肿瘤组织内BANCR表达上调明显，差异有统计学意义(X2 = 16.151, P < 0.001)，TSHR甲基化BRAFV600E突变的PTC患者例数显著高于非甲基化BRAFV600E突变的PTC患者，差异均具有统计学意义(P均 < 0．01)。与其他学者的研究结论的34%~87% [21] [22] [23] 相近。癌组织中TSHR甲基化和BANCR的表达水平以及两者结合分别检测出的阳性例数均显著高于癌旁组织，差异具有统计学差异(表1，P均 < 0.001)。表明BRAFV600E突变的PTC癌组织中TSHR甲基化程度上调趋势且伴有BANCR呈现高表达，与以往学者研究结果一致 [21] [22] [24] 。
另外，我们研究发现BRAFV600E突变的PTC患者肿瘤组织内BANCR表达水平与不同性别、是否侵及被膜、是否多灶癌及不同肿瘤直径等病理特征无显著性差异，但BRAFV600E突变的PTC伴有颈部淋巴结转移患者BANCR高表达例数与低表达BRAFV600E突变的PTC患者相比明显升高，同时癌组织中TSHR基因分别在侵及被膜、多灶癌、淋巴结转移的PTC患者中表现出显著的高甲基化(P均 < 0.05)，表明TSHR的甲基化和BANCR高表达预示着BRAFV600E突变的PTC患者发生淋巴结转移风险较高且预后相对较差，从而对该癌症的临床诊断及术后复发风险评估具有一定价值。
同时BANCR高表达联合TSHR甲基化对BRAFV600E突变的PTC诊断的特异性、灵敏度和准确性与单项检测数据相比均表现升高趋势，但差异无统计学意义(P < 0.05)，而仅灵敏度与两项指标单一检测相比差异具有统计学意义(P < 0.05)，表明BANCR表达联合TSHR甲基化检测在BRAFV600E突变的PTC的诊断中具有较高灵敏度，目前术前FNAC检查联合基因检测指标是术前诊断PTC的研究热点，因此可以将我们研究的两种基因结论作为术前诊断PTC的分子生物学指标，但目前仍存在不足，后续将增加样本量对该应用进行深入研究。
5. 结论
综上，与癌旁正常组织相比，BRAFV600E突变的PTC中TSHR甲基化程度明显升高，同时TSHR甲基化与原发灶数量、被膜侵犯、淋巴转移有关，BANCR表达和TSHR甲基化与BRAFV600E突变的PTC患者颈部淋巴结转移情况密切相关，且对PTC临床诊断具有较佳的灵敏度。因此BANCR高表达和TSHR基因的甲基化失活可能促进PTC进展和转移复发，并预示了不良预后。同时，该基因的甲基化与BRAFV600E突变之间的关系值得大样本临床研究进一步深入探讨。
基金项目
黑龙江省自然科学基金项目(合同编号LH2021H115)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。