PABPC4及MYC诱导形成的肝癌的研究进展

Research Progress of PABPC4 and Hepatocellular Carcinoma Induced by MYC

摘要: 肝癌是影响人们健康的最常见癌症之一，具有高侵袭性、预后差及治疗选择有限的临床特点，已成为全球第六大常见癌症，致死率居全球第三。c-Myc是肝细胞肝癌(HCC)发育中的一个重要致癌基因，在18%的人类HCC中被发现被扩增或上调，但同时c-Myc是一种多效性转录因子，对正常细胞增殖和维持干细胞至关重要，尽管c-Myc抑制剂现在正在临床上进行测试，但仍有可能具有局限性。c-Myc致瘤作用及其下游调控的基因和信号通路仍有待充分研究，寻找新的早期诊断和靶向治疗分子等为肝癌的预防和治疗带来新的方法和策略。细胞质多聚腺苷酸结合蛋白4 (PABPC4)是一种RNA加工蛋白，在调节基因表达中起重要作用。越来越多的证据表明了PABPC4在肿瘤发生中的独特作用。本综述的目的是解释c-Myc在肿瘤发展中的作用以及PABPC4的研究现状。

Abstract: Hepatocellular carcinoma is one of the most common cancers affecting people’s health. It has be-come the sixth most common cancer in the world and the third deadliest cancer in the world due to its high aggressiveness, poor prognosis and limited treatment options. c-Myc is an important onco-gene in HCC development and has been found to be amplified or upregulated in 18% of human HCC, but at the same time, c-Myc is a pleiotropic transcription factor that is essential for normal cell pro-liferation and maintenance of stem cells, and although c-Myc inhibitors are now being tested clini-cally, they are still likely to have limitations. The oncogenic effect of c-Myc and its downstream reg-ulation of genes and signaling pathways remain to be fully studied, and new early diagnosis and targeted therapeutic molecules are sought to bring new methods and strategies for the prevention and treatment of liver cancer. Cytoplasmic PABPC4 is an RNA processing protein that plays an im-portant role in regulating gene expression. There is increasing evidence for the unique role of PABPC4 in tumorigenesis. The purpose of this review is to explain the role of c-Myc in tumor devel-opment and the current status of PABPC4 research.

1. 肝癌研究现状

1.1. 肝癌的流行病学概况

肝癌是影响人们健康的最常见癌症之一，男性发病率明显高于女性，并且随着人口的增长和老龄化呈现出不断增加的态势。根据世界卫生组织发布的数据(GLOBOCAN, 2012)，在2012年度，全球新发肝癌病例782,451例，其中男性554,369例，在所有新发癌症中排名第五；女性228,082例，在所有新发癌症中排名第八。全球因肝癌而死亡的人数745,533例，其中男性521,041例，在所有癌症死亡病例中排名第二，仅次于肺癌；女性224,492例，在所有癌症死亡病例中排名第六 [1] 。而在我国，肝癌在所有癌症死亡病例中排名第三。我国肝癌的发病和病死数量超过全世界的50%，并且发病率和致死率都高于世界平均水平 [2] 。这说明在我国肝癌已经严重威胁到人民群众的生命健康，已经成为影响我国人民生活水平和经济社会发展的重要负担因素之一，因此在我们国家研究肝癌的发病原因及机制，为肝癌治疗提供理论依据和策略具有非常重要的现实意义。

1.2. 肝癌的流行病学概况

肝癌已经成为威胁人类健康的重大癌症之一，然而人们对肝癌发生的机制认识仍然很有限。根据肝癌的发生情况来看，其发病可能与地域、种族以及性别相关，但最为重要的因素还是与食用含有黄曲霉素B的霉变食物、乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus, HBV)及丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus, HCV)的感染、长期饮酒以及肝硬化和其它代谢疾病如遗传性血色素沉着症、酪氨酸血症、抗胰蛋白酶缺陷、糖尿病及非酒精性脂肪肝等相关。肝癌的治疗和其它肿瘤治疗相似，但根据肝脏器官的特点又有所不同，主要包括外科手术、肿瘤消融术、肿瘤栓塞术、放射治疗、化学治疗和靶向治疗 [2] 。近年来，以索拉非尼为代表的多激酶抑制剂及多种程序性死亡受体1/程序性死亡配体-1 (PD-1/PD-L1)单抗等免疫检查点抑制剂虽已纳入治疗指南 [3] ，但治疗效果仍然有限 [4] ，患者的5年生存率极低。因此，深入探索并进一步明确肝癌的发病机制、寻找特异性治疗靶点，是未来临床研究的重点和难点 [5] 。

2. MYC癌基因概述

c-Myc是一种高度多效性的转录因子，已知可控制细胞周期进程、增殖、生长、粘附、分化、凋亡和代谢 [6] 。c-Myc基因在40年前被发现，是导致酵母细胞瘤病(白血病和肉瘤)的逆转录病毒v-Myc癌基因的细胞同源物，从那时起，它可能成为人类生物学史上研究最多的蛋白质之一，随后发现在伯基特淋巴瘤中，人类Myc通过平衡染色体易位持续改变 [6] 。这些发现引起了c-Myc研究的广泛关注，c-Myc原癌基因后来被发现在超过一半的人类癌症中被激活。c-Myc属于MYC基因家族，其包括b-Myc、i-Myc、n-Myc和s-Myc，然而，只有c-Myc、i-Myc和n-Myc具有致瘤潜在性。许多机制涉及肿瘤发生过程中的c-Myc激活，包括染色体重排、基因扩增和编码序列中的点突变，通过使用体外细胞培养和体内小鼠模型的广泛研究，已经充分证明了c-Myc促进肿瘤发生的强大转化活性 [7] 。自20世纪80年代以来，c-Myc的研究主要集中在其在肝癌发生过程中的作用上 [8] 。c-Myc促进肝肿瘤发生的能力不仅在体外和体内的研究中得到了证实，而且在人类癌症中也得到了证实。c-Myc存在于高达70%的病毒和酒精相关的HCC中，其表达的升高促进肝细胞生长，驱动HCC的起始和进展，并通常与不良的癌症预后相关 [9] 。

2.1. MYC的结构和功能

Myc蛋白包含一个非结构化的N端转录调控域，其中包含保守的Myc盒子I和II，其次是Myc盒子III和IV和一个核靶向序列，C端结构域由一个基本的HLH-Zip结构域组成。N端结构域已被证明与许多包括TRRAP、GCN5和TBP在内的因子形成复合物，这些复合物可能诱导N端Myc转录调控结构域更结构化的折叠 [10] 。随着Armelin等发现Myc的表达与细胞的生长相关，同时它的过表达可以减少组织培养细胞的快速增殖对血清的依赖(Armelinetal 1984)，科学界便出现了两种关于Myc的作用机制模型：一种认为Myc直接调控DNA的复制，另一种则认为Myc是基因转录的调控因子。在非洲爪蛙的发育早期的一段时间内母系Myc蛋白被招募到核内，这一时期的细胞转录停止，DNA大量复制，因此研究者认为Myc可能直接调控DNA的复制(Gussetal 1989)。随后关于Myc调控DNA复制的报道也不断出现，尽管如此，更多研究者却更倾向于认为Myc功能是作为转录因子来调控基因的转录 [11] 。

2.2. MYC在肝脏中的作用

2.2.1. MYC对肝细胞的增殖作用

已经有研究表明，用c-Myc基因电穿孔培养的肝细胞的DNA合成率比未处理的肝细胞培养物高约50%。重要的是，这种合成率的增加依赖于转染了c-Myc的DNA的数量 [6] 。来自再生肝的静止期和增殖期的肝细胞含有类似水平的c-Myc蛋白。在静止细胞中，c-Myc通常定位于核仁，而部分肝切除术(PH)则诱导其核易位，因此，c-Myc定位与细胞增殖也密切相关 [12] 。c-Myc的表达通过调节细胞周期蛋白依赖的激酶复合物，促进包括肝细胞在内的多种细胞类型从细胞周期的G0、G1期到S期的过渡。在PH术后再生肝细胞中观察到的G0、G1到S期的转变与c-Myc和n-Myc转录本的快速诱导相关。在肝脏中过表达c-Myc的转基因小鼠显示出细胞增殖和凋亡的增加 [13] 。c-Myc在70% PH术后肝脏的再生反应中起着关键作用，在此过程中，静止的肝细胞同步进入细胞周期，并经历一轮、两轮或更多的复制。c-Myc的表达在复制前阶段迅速增加，在PH前30分钟DNA合成之前，在2小时达到峰值，在PH后8小时达到第二个峰值 [8] 。

2.2.2. MYC与肝脏疾病的关系

1) MYC与酒精性肝病的关系

酒精性肝病与肝细胞肝癌的关系密切，肝脏c-Myc在乙醇(ETOH)喂养的WT小鼠中强烈上调。转录组分析表明，在ETOH喂养的Alb-Myctg小鼠中，ER应激、P53信号通路、肝纤维化、细胞周期调节、核糖体合成和葡萄糖稳态相关通路变化。基因和蛋白表达分析显示，小鼠在肝损伤的初期阶段，c-Myc表达显著上调。治疗2周后，肝细胞中的c-Myc主要在细胞核中表达，而在酒精摄取4周后，它则定位于细胞质和细胞核中。与在体内的研究结果一致，体外原代肝细胞中也上调c-Myc基因表达，并呈剂量依赖性。在肝细胞中，c-Myc的转基因表达导致肝细胞早期球样变性，肝胶原沉积增加和肝脂肪变性。此外，ETOH喂养的Alb-Myctg小鼠表现出与能量功能障碍相关的线粒体形态的显著变化。通路分析显示，c-Myc表达和乙醇摄取的升高会共同导致强烈的AKT激活及MDM2磷酸化，从而抑制P53。HE染色显示Alb-Myctg肝气球样变损伤增加，肝细胞增大圆形，胞质染色浅染，核增大显著。c-Myc表达触发了间质促纤维化，如增强胶原表达和沉积(Masson三色染色显示)。70%的酒精相关HCC和不同病因的肝纤维化患者中显示原癌基因c-Myc表达增加 [14] 。事实上，c-Myc表达上调，特别是在与纤维化3期和4期相关的晚期ALD患者中，主要局限于胆管细胞，少量局限于肝细胞。c-Myc和ETOH同时存在会导致细胞增殖受损、促纤维化信号通路增加、脂肪代谢改变、过度活性氧积累、线粒体形态改变和p53抑制 [15] 。

2) MYC与肝细胞肝癌的关系

MYC致癌基因是与肝肿瘤发病机制相关的最常见的激活致癌基因之一。MYC促进肝肿瘤发生的能力不仅在体外和体内的研究中得到了证实，而且在人类癌症中也得到了证实 [16] 。Kim等人评估了使用重组腺病毒转染c-Myc，将人c-Myc基因转到小鼠肝脏，c-Myc异位表达引起肝细胞肥大，且c-Myc依赖的细胞肥大发生在肝脏中没有细胞增殖的情况下，同时肝细胞细胞核和核仁也增大(与大亚基和小亚基核糖体上调有关) [17] 。在c-Myctg动物中观察到的HCC的组织学类型可以是小梁的，也可以是实体型的，从分化良好到低分化的肿瘤，包括细胞多态性、异型性和出血性坏死 [3] 。与对照组相比，高表达c-Myc导致细胞形态紊乱，失去正常结构，白蛋白表达降低。这些癌症再现了c-Myc阳性的人类HCC的典型组织学特征：一种巢状分布的模式，结节内没有纤维间质，并且c-Myc和人类特异性Ki-67呈阳性。此外，结节内的癌细胞GPC-3阳性，胞浆嗜碱性，核仁明显，高有丝分裂活性，是人高级别肝细胞肝癌的典型特征 [18] 。

当MYC保持失活，许多这些肿瘤细胞就会处于休眠状态；然而，MYC的再活化立即恢复了它们的肿瘤特征。通过基因组杂交，证实了这些休眠的肝细胞和恢复的肿瘤保留了相同的分子特征，因此是从肿瘤细胞中克隆衍生出来的。当MYC失活后，大部分肿瘤细胞分化为正常的肝细胞，形成正常的肝结构。肿瘤失去了肿瘤组织学特征，如高有丝分裂指数、大核仁，现在表现出正常的核/细胞质比。分化后的肿瘤细胞Ki-67阴性，与细胞增殖率降低相一致。大多数肿瘤细胞失去了未成熟分化标志物甲胎蛋白(AFP)的表达，而是表达了肝细胞和胆道细胞标志物，与肝窦、胆管和胆管细胞的形成一致。在MYC再活化的2周内，有肿瘤再生长的明显证据。肿瘤被发现与原始肿瘤具有相同的组织学特征。因此，MYC失活导致了肝肿瘤的分化，但这些肿瘤保留了在MYC再活化后恢复其肿瘤特征的潜在能力 [19] 。所以需要联合其他分子靶向治疗。

2.3. MYC相关的治疗

BET溴化结构域调控蛋白最近在不同肿瘤类型中作为MYC表达的有效调控因子出现。特别是多发性骨髓瘤，一种恶性浆细胞瘤中，抑制BET会导致MYC表达的显著减少和相关的细胞死亡 [20] 。肿瘤生长也可以通过MYC诱导的细胞生物量积累中涉及葡萄糖或谷氨酰胺代谢的药物解耦生物能量途径来抑制，MYC靶基因如鸟氨酸脱羧酶(ODC)、乳酸脱氢酶A (LDHA)和谷氨酰胺酶(GLS)也成为shRNA或类似药物的靶向小分子 [21] 。其他阻止MYC在癌症作用上的方法包括靶向Myc-Max二聚体或Myc诱导的microRNA表达。

在这里，我们回顾了我们对MYC的丰富理解，强调了新的生物学见解和癌症治疗的进展。不过即使对MYC或其靶基因有良好的临床前反应，但肿瘤类型和背景也将增加对任何一种治疗反应的复杂性和异质性。

3. PABPC4研究现状

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构和3’端20~30个腺苷酸组成的Poly A尾。关键在于帽子和尾巴上存在甲基化修饰，那些5’端上的修饰可以维持mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻译起始等。而3’端Poly A发生的修饰有助于出核转运、翻译起始，其与Poly A结合蛋白一起维持mRNA的结构稳定。Poly A结合蛋白(PABP)是一种多功能的RNA结合蛋白，这些高度保守的多肽只在真核生物中发现，每个单细胞真核生物都有一个PABP，而人类有5个 [22] 。PABPs参与mRNA的所有代谢途径：多聚腺苷化/去烯化、mRNA输出、翻译、mRNA降解、mi-croRNA相关调控和发育过程中的表达调控。最初人们认为PABPs的作用是通过与Poly A尾巴相互作用来保护mRNA免被降解 [23] 。然而，大量的研究表明，PABPs可以与RNA和蛋白质因子中的其他调控序列相互作用，使PABPs家族在许多基因表达途径中起着关键作用。PABPs似乎缺乏其自身的催化活性，但介导了影响这些过程的因子和RNA之间的相互作用。这种多功能类蛋白质的新作用正在被发现。

3.1. PABPCs的结构及功能

一个典型的PABPC分子量约为70 kDa，在其N端包含4个标准RNA结合域的重复序列，即所谓的RNP (核糖核蛋白)结构域或RRM (RNA识别基序)，通过短连接序列连接。在大多数PABP家族成员中，大约有75个氨基酸的C端结构域也是保守的 [24] 。PABPC在真核生物中高度保守，具有4个N端RNA识别基序(RNA recognition motif, RRM)结构域，它们以纳摩尔亲和力结合Poly A尾；真核翻译起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E)识别5’帽并与另一种翻译起始因子eIF4G相互作用，后者又与PABPC结合。因此，mRNAs可以形成一个“闭环”，使5’帽和3’Poly A尾之间的直接物理通信成为可能 [25] 。

3.1.1. PABPCs基础功能

细胞质mRNA最主要的降解途径是通过缩短Poly A尾巴启动的，此过程称为去腺苷酸化，Poly A尾缩短或去腺苷酸化需要在释放PABPCs之前，进而mRNA衰变才可以进行，经实验证明，在体外测定中添加过量的PABPCs会抑制去腺苷酸化；PABP1在mRNA转换中也有多种不太明确的作用 [26] 。其中，它最突出的作用是保护Poly A尾巴不受去烯化(Poly A去除)，这是mRNA周转的第一个和速率限制步骤；矛盾的是，PABP1也将去烯化酶招募到mRNA上，并被认为可以协调翻译终止和去烯化，从而调节mRNA的寿命。PABPC4与PABP1高度相似，因此PABPC4和PABP1可能在调节mRNA的翻译和稳定性方面具有相似的功能 [24] 。虽然尚未研究PABPC4调控去烯化的能力，但哺乳动物PABPC4还表现出对富AU序列的偏好 [27] 。在脊椎动物中，PABPC4缺失主要导致前部形态缺陷(如头侧和腹侧水肿、头部畸形、眼睛发育不良、消化道畸形)和游泳运动异常。PABPC4的表型表达比PABP1更晚，而PABPC4缺陷的胚胎直到第50期才死亡，这说明PABPC4对哺乳动物生长生殖具有重要作用 [28] 。

3.1.2. PABPCs新功能的发现

最初人们认为PABPCs的作用是通过与Poly A尾巴相互作用来保护mRNA免被降解 [29] ；然而，大量的研究表明，PABPCs在体内不仅可以结合Poly A，还可以与一些mRNA上的其他位点结合。虽然PABPCs主要与mRNA的Poly A尾巴结合，但如果细胞胞质PABPCs的数量超过了可用的Poly A尾巴所需的数量，PABPCs可能结合额外的RNA位点 [30] 。此外翻译后的磷酸化或甲基化等修饰可能会不同地影响PABPCs对不同RNA序列的亲和力，从而改变PABPCs对不同RNA序列的选择性程度，使PABPCs家族在许多基因表达途径中起着关键作用 [31] 。PABPCs似乎缺乏其自身的催化活性，但介导了影响这些过程的因子和RNA之间的相互作用。这种多功能类蛋白质的新作用正在被发现 [32] 。

3.2. PABPC4与代谢的关系

有研究表明，PABPC4沉默的细胞具有更大的脂质代谢能力，减少细胞内脂滴，并减少细胞死亡。PABPC4的沉默诱导氧化表型，并通过增加线粒体呼吸、柠檬酸合酶活性、mtDNA含量和释放到细胞外培养基中的乳酸的减少来证明 [33] 。PABPC4在结构和功能上与PABP1相似 [34] ，并在骨骼肌中富集，但PABPC4单独是线粒体功能的关键调节因子，并支持其可能参与骨骼肌细胞代谢应激过程中的线粒体调节，而PABP1不具有此功能 [27] 。PABPC4 KD细胞具有较高的氧化磷酸化能力，并且这种作用在低糖处理下更为明显。在多种代谢应激源下，PABPC4蛋白含量降低，且PABPC4表达的减少可能是促进骨骼肌细胞线粒体功能所需的适应性事件。近年来，人们对PABPC4的兴趣越来越大。有文献报道，在用CRISPR/Cas9基因编辑系统破坏了人类细胞中的PABP1，发现PABPC4水平的升高弥补了部分PABP1的损失，PABP1和PABPC4的占比的变化并没有改变细胞的增殖和形态 [35] ；过表达PABP1抑制了细胞中升高的PABPC4，而过表达PABPC4抑制了内源性的PABP1。这表明，这两种亚型在维持基本的细胞活动方面具有冗余性。

3.3. PABPC4与肝癌及其他肿瘤的关系

越来越多的证据表明PABPC4在肿瘤发生中的独特作用 [36] 。一项纳入101例结直肠癌临床样本的组织病理学研究显示，PABPC4在人类结直肠癌中高表达，预后较好 [37] 。后来有研究表明在三阴性乳腺癌中PABPC4的下调降低了细胞的生长和侵袭能力 [38] 。然而PABPC4在肝细胞癌中的表达和作用仍然未知。Yuanzhuo Gu课题组实验表明，与非肿瘤组织相比，PABPC4在肝癌肿瘤组织中显著上调，据PABPC4表达水平将队列1中的176名肝细胞癌患者分为4组，然后比较PABPC4表达最高的四分位数(PABPC4⁺ HCCs)和PABPC4最低四分位数(PABPC4-HCCs)水平的肝细胞癌病例之间的基因表达谱。共有985个基因在PABPC4⁺肝细胞癌中表现出显著较高的水平，包括AFP和Myc在内的4个基因的表达量增加了至少5倍。PABPC4⁺肝细胞癌中437个基因的表达显著降低，17个基因的下降幅度低于0.2倍，其中14个基因与肝脏代谢功能明显相关，包括SDS、SLC10A1和CYP。与PABPC4⁻肝细胞相比，两个队列中PABPC4⁺肝细胞癌的AFP水平显着更高，SDS水平显着降低。这些结果表明，HCC中高度异常表达的PABPC4可能在增加肿瘤干细胞(Cancer stem cell, CSC)相关恶性特征中发挥重要作用 [39] 。来自TCGA的数据显示，PABPC4在HCC中高度表达，并与肿瘤分期和分级相关，且生存分析显示，PABPC4高表达的患者生存时间较短 [36] 。PABPC4已被证明与炎症反应物蛋白和抗丙型肝炎反应相关，并在肿瘤组织中更高水平表达 [32] 。

4. PABPC4与MYC癌基因的关联研究

Yuanzhuo Gu课题组评估了一组编码调节蛋白的mRNA的表达，这些mRNA通常在红系早期阶段高水平表达，并在终末分化过程中受到抑制。这些基因包括c-Myc、c-Myb、CD44、Stat5A和c-Kit。在分化72小时，PABPC4的缺失对前4个基因的mRNA表达没有明显的影响。相反，在未诱导PABPC4耗尽的细胞中，c-Kit mRNA异常升高。在PABPC4缺失的红细胞分化的小鼠红白血病细胞(MEL)中，c-Kit的减弱和红细胞分化的持续表达一致，PABPC4缺失干扰正常的c-Kit抑制可能有助于抑制末端红系成熟和对关键红系基因活性的相关抑制 [40] 。

最近有研究表明，PABPC4升高的细胞的转录组谱发生了变化。为了推断转录组变化背后的生物学上重要的基因，使用基因集合富集分析检测了50个标志性特征基因集的富集。分析表明，c-Myc是富集途径中最多的基因，并通过western blotting和qRT-PCR证实了c-Myc mRNA转录水平的升高。该实验组用siRNA敲除clon-CLC4细胞中PABPCs的表达，发现c-Myc蛋白水平降低与PABPC4耗竭相关。在clon-CLC4中过表达的PABP1-GFP抑制了内源性PABPC4蛋白，但是PABP1-GFP的增加并没有降低c-Myc mRNA水平。于是推断，PABP1可能需要更长的时间才能间接影响c-Myc mRNA的表达量。分别敲除PABPC4和PABP1后发现，前者降低了c-Myc表达，而后者使得c-Myc升高。这证实了PABPCs可以通过c-Myc影响转录。而PABPC4与c-Myc的相关性机制有待进一步研究 [35] 。

5. 展望

PABPC4在HCC中的表达情况及临床价值、PABPC4联合c-Myc同时在HCC中表达的研究报道都少见。所以需要在临床病人组织中继续验证两者与肝癌的发生的相关性。探明HCC组织及癌旁非瘤组织中PABPC4和c-Myc的表达差异，分析两者的表达水平与HCC患者的临床病理特征、预后之间的关系，同时分析PABPC4和c-Myc在HCC组织中表达的相关性。探讨PABPC4和c-Myc在HCC发生发展及预后中的作用，寻找HCC预后判断的分子标志物，探讨PABPC4是否可以作为生物标志物和治疗靶点，为肿瘤的诊断和治疗带来新的突破。