1. 引言
肾透明细胞癌(Clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是最常见且侵袭性最强的肾癌组织病理类型。我国肾癌发病率逐年上升，已成为泌尿系统常见的肿瘤疾病。肾癌的治疗手段较为单一，且患者预后较差。因此，进一步探索肾癌的病理生理机制进而寻找相应干预措施，是当前肿瘤学界共同面对的重要科学问题。
代谢异常是肿瘤的十大特征之一。有研究表明，肿瘤的生长和生存很大程度上依赖线粒体功能，包括脂质、核苷酸和氨基酸的合成、线粒体介导的凋亡以及OXPHOS [1] [2] 。肿瘤线粒体功能的异常，可能使肿瘤代谢发生改变，促进细胞增殖和肿瘤发生。因此研究肾癌呼吸链的关键调控蛋白可能会解释肾癌代谢重组的机制。近年来，MRPL12被报道为许多疾病的致病因子，包括癌症 [3] [4] 。MRPL12对线粒体的调控作用，在细胞生长 [5] 、肿瘤细胞增殖和迁移 [3] 、细胞能量代谢 [6] [7] 中发挥重要作用。
在本研究中，我们就MRPL12分子对线粒体的调控作用进行论述，通过生信分析预估MRPL12与肾透明细胞癌的相关性，为MRPL12在肾透明细胞癌中的作用提供了新的见解，同时为基础研究与临床治疗提供了新的方向。
2. 资料与方法
1) 数据采集
通过UCSC数据库下载癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)和基因型–组织表达(The Genotype-Tissue Expression, GTEx)的RNA表达和临床数据。通过GeneCards数据库下载MRPL12的基因数据。
2) 泛癌分析
下载TCGA TAGRET GTEx (PANCAN, N = 19,131, G = 60,499)泛癌数据集，从中提取ENSG00000262814 (MRPL12)基因在各个样本中的表达数据，进一步对每一个表达值进行log2(x + 0.001)变换，剔除单个癌种中样本个数小于3个的癌种，最终获得了32个癌种的表达数据。通过R语言计算每个肿瘤中正常样本和肿瘤样本的表达差异，使用非配对的Wilcoxon Tests进行差异显著性分析。
3) 预后分析
下载已发表于《Cell》上的TCGA预后数据集，从UCSC数据库中获取TARGET随访数据作为补充，并剔除随访时间短于30天的样本，进一步的对每一个表达值进行log2(x + 0.001)变换。采用Kaplan-Meier分析评估MRPL12在TCGA队列肾透明细胞癌患者的总生存期(Overall Survival, OS)中的影响。
4) 下载TCGA数据库有关肾透明细胞癌的数据，通过R语言分析得到MRPL12在ccRCC患者中配对样本与非配对样本的表达情况。
5) 查询Ualcan网站分析MRPL12在健康人群和ccRCC患者中的表达差异以及与ccRCC分级、分期的相关性。
6) 统计学方法
使用R语言4.2.2软件进行数据统计分析，计量资料使用平均值±标准差(x ± s)表示，使用t检验分析组间差异。p < 0.05被认为具有统计学意义。
3. MRPL12概述及生物学功能
3.1. 概述
线粒体被认为是古代细菌的后代，其内有一套独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA (mtDNA)，这些DNA编码哺乳动物氧化磷酸化所必需的13种蛋白质 [8] 。线粒体核糖体在这个翻译系统中扮演着核心角色。
1967年，O’Brien和Kalf等在大鼠肝脏细胞的线粒体中发现核糖体 [9] [10] 。线粒体核糖体是目前已知的蛋白质含量最高的一类核糖体，为55-60S颗粒，由小的28S和大的39S亚基组成 [11] 。哺乳动物核糖体区别于细菌核糖体的一个特征是蛋白质含量增加 [12] 。
人类线粒体蛋白质合成机制被称为mitoribosome。虽然线粒体的RNA是由线粒体DNA转录而来，但参与线粒体翻译系统的蛋白质却是由核基因组编码的。这些参与线粒体翻译的核糖体蛋白简称“MRP”(线粒体核糖体蛋白)，后面的L代表大亚单位蛋白，S代表小亚单位蛋白。它们在细胞质中合成后进入线粒体，在线粒体中组装成核糖体，参与翻译过程 [13] 。人线粒体核糖体蛋白(MRP)基因家族由30个编码线粒体核糖体小亚基的基因和50个编码线粒体核糖体大亚基的基因组成 [12] 。
线粒体核糖体蛋白12 (Mitochondrial ribosomal protein L7/L12, MRPL12)是哺乳动物中鉴定出来的第一种线粒体核糖体蛋白，分子量21 kDa，由198个氨基酸组成，是线粒体核糖体上延伸因子的初始结合位点 [14] 。利用SOPMA在线网站对MRPL12的基本二级结构进行分析，结果表明MRPL12的蛋白质二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲组成(见表1)。人类MRPL12蛋白由位于17号染色体(q25-qter)上的独特基因编码。MRPL12基因的表达主要在转录水平上受到调控，在G1期中期被短暂激活，其mRNA表达受到生长因子的正调控 [15] 。
Table 1. Predictive analysis of the secondary structure of the MRPL12 protein
表1. MRPL12蛋白的二级结构预测分析
3.2. 生物学功能
功能上，MRPL12通过参与线粒体蛋白的翻译、直接与POLRMT结合激活mtDNA转录、启动线粒体生物合成和调节线粒体OXPHOS发挥关键作用 [16] [17] 。
1) MRPL12由核基因编码，在细胞核中合成后转运到线粒体，它在横跨线粒体膜的易位过程中被切割，作为二聚体结合大核糖体亚基，参与线粒体蛋白质的合成。MRPL12是线粒体核糖体上延伸因子的初始结合位点，这种蛋白质的突变可能会严重损害核糖体的功能，以至于线粒体蛋白质合成的产物甚至不足以维持基础代谢率。
2) MRPL12还能够直接结合于RNA多聚酶POLRMT，参与线粒体基因转录的调控 [6] [17] 。MRPL12参与线粒体基因转录主要通过两种方式，一种依赖于核糖体，通过启动子依赖性和启动子非依赖性激活线粒体转录；另一种不依赖于核糖体，通过“自由池”发挥作用，促进从起始到延伸的转录过渡作用 [18] 。
3) MRPL12功能受损可导致细胞生长速率降低，并与线粒体ATP生成减少相关 [12] 。MRPL12基因的c.542C>t转化直接导致线粒体OXPHOS复合物的异常组装，并伴有整个线粒体翻译和OXPHOS表达及活性的缺陷 [19] 。基础研究发现，MRPL12敲除后线粒体转录大幅降低，线粒体RNA合成急剧下降，线粒体生物合成能力严重受损 [6] [17] 。病例分析发现，MRPL12基因突变病人线粒体氧化磷酸化水平明显下降，生物合成能力受损，病人表现出生长迟缓、神经系统退化和线粒体翻译缺陷等特征 [19] 。MRPL12的突变缺失直接导致了线粒体OXPHOS电子传递链复合物I和IV的异常组装，伴随着整个线粒体翻译和OXPHOS的功能缺陷 [6] 。
因此，MRPL12是调节线粒体生物合成及能量代谢的关键蛋白。
4. MRPL12与肾透明细胞癌的相关性
通过生物信息学的方法分析预估MRPL12与肾透明细胞癌的相关性。
4.1. MRPL12的泛癌分析
使用TCGA数据库对MRPL12在各个样本的表达情况进行泛癌分析，结果显示，MRPL12在肺鳞癌、肺腺癌、胃癌、肝细胞癌、结直肠癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、甲状腺癌等29种癌症中显著上调，在肾透明细胞癌中显著下调(见图1)。
GBM：多形成性胶质细胞瘤；GBMLGG：胶质瘤；LGG：脑低级别胶质瘤；UCEC：宫内膜癌；BRCA：乳腺浸润癌；CESC：宫颈鳞癌和腺癌；LUAD：肺腺癌；ESCA：食管癌；STES：胃和食管癌；KIRP：肾乳头状细胞癌；KIPAN：混合肾癌；COAD：结肠癌；COADREAD：结直肠癌；PRAD：前列腺癌；STAD：胃癌；HNSC：头颈鳞状细胞癌；KIRC：肾透明细胞癌；LUSC：肺鳞癌；LIHC：肝细胞肝癌；SKCM：黑色素瘤；BLCA：膀胱尿路上皮癌；THCA：甲状腺癌；READ：直肠腺癌；OV：卵巢浆液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；TGCT：睾丸癌；UCS：子宫癌肉瘤；ALL：白血病；LAML：急性髓细胞性白血病；ACC：肾上腺皮质癌；KICH：肾嫌色细胞癌；CHOL：胆管癌。
图1. MRPL12在各种癌症中的表达差异
4.2. MRPL12在肾透明细胞癌中的表达分析
由于MRPL12在肾透明细胞癌中低表达与其他肿瘤存在显著差异，我们下载TCGA数据库有关ccRCC的数据，并通过R语言进行分析，得到MRPL12在ccRCC中配对样本与非配对样本的表达情况。结果显示，MRPL12在非配对样本和配对样本中表达均下调(见图2(a)，图2(b))。通过查询Ualcan网站分析MRPL12在健康人群与ccRCC患者中的表达差异(Normal n = 72, Primary tumor n = 533)。结果显示，与健康人群相比，MRPL12在ccRCC中表达减少(见图2(d))。同时，我们进一步评估了MRPL12在ccRCC两种分子亚型ccA和ccB中的表达差异，结果显示MRPL12在两种分子亚型中表达均减少(Normal n = 72, ccA subtype n = 205, ccB subtype n = 175) (见图2(e))。
4.3. MRPL12与肾透明细胞癌的预后分析
Kaplan-Meier OS分析结果表明，MRPL12为ccRCC患者的保护因素，低表达MRPL12的患者预后更差(见图2(c))。
4.4. MRPL12与肾透明细胞癌临床分级、分期的相关性
查询Ualcan网站，分析MRPL12在ccRCC分级、分期中的表达差异。结果显示，MRPL12的表达与ccRCC分级、分期均存在显著相关性，说明MRPL12可能参与ccRCC的临床病程进展(见图2(f)，图2(g))。
5. MRPs家族其他成员在肿瘤中的研究进展
研究发现，MRPs生理功能的改变与肿瘤发生发展有关。人头颈部鳞状细胞癌在进展过程中出现OXPHOS复合物表达改变和线粒体翻译缺陷，与MRPL11的表达减少相关 [20] ；MRPS31缺乏是肝癌线粒体功能障碍的重要驱动因素，MRPS31抑制可显著促进肝癌细胞侵袭 [21] 。MRPL13在乳腺癌中的高表达与较差的生存率显著相关，是预测乳腺癌预后和免疫治疗反应的生物标志物 [22] 。MRPL20的表达水平在雄激素非依赖性前列腺癌中显著下调，可能在雄激素抵抗中起到潜在作用 [23] ；MRPL28基因在胰腺肿瘤细胞中的敲除导致线粒体活性降低，糖酵解增加，并伴有细胞增殖减少 [24] 。
6. 总结与展望
线粒体是进行氧化代谢的重要部位，近年来，它作为癌症潜在的治疗靶点受到了广泛关注 [25] [26] 。许多癌症的研究发现，控制肿瘤能量和生物合成的代谢途径发生了变化，即所谓的代谢重编程，肾癌是以代谢重编程为特征的肿瘤 [27] [28] 。MRPL12作为调控线粒体mtDNA转录和生物合成的蛋白，在启动线粒体生物合成和调节线粒体OXPHOS等方面发挥着重要作用。
本研究针对MRPL12分子对线粒体的调控作用进行讨论，同时运用多种生物信息学的分析方法，对MRPL12在肾透明细胞癌中的表达进行综合分析后得出：MRPL12的表达量与ccRCC的发生发展存在相关性。
因此，进一步研究MRPL12在肾透明细胞癌中的分子机制和功能将有助于探索ccRCC的病理生理机制，进而寻找相应的干预措施，靶向MRPL12可能会为ccRCC的治疗开辟一条新的途径。