1. 引言
心力衰竭(Heart Failure, HF)是由于心脏结构及功能异常导致心脏充盈及射血功能障碍所引发的复杂临床综合征 [1] [2] [3] 。目前约有600万成年人患有心力衰竭，死亡率居高不下 [4] 。心肌梗塞会破坏心肌组织，从而导致心力衰竭 [5] [6] [7] 。近年来研究发现中药复方芪苈山萸心衰方具有利尿和抑制神经内分泌过度激活的作用，能够改善血流动力学，减少心室重构，缓解心力衰竭和改善预后 [8] 。现阶段芪苈山萸心衰方在临床上用于治疗充血性心力衰竭，先前有研究通过临床收集102例慢性心力衰竭患者，并与西药治疗组进行对照，结果发现使用芪苈山萸心衰方的患者心功能得到明显改善，总体有效率达到80.4%，在临床上取得了较好的疗效 [9] [10] [11] 。但其相关作用靶点和具体药效物质及作用机制并不明确。因此，本研究的目的是寻找药物成分与靶点之间的关联性，尝试探究芪苈山萸心衰方治疗心梗后心衰的药效物质及作用机制。
2. 材料
2.1. 实验动物
清洁级SD雄性大鼠60只，体质量(180 ± 20) g，购自三峡大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SYXK(鄂) 2017-0061。
2.2. 药物试剂
芪苈山萸心衰方(由黄芪30 g，葶苈子15 g，山茱萸20 g，北五加皮10 g，大枣20 g，龙牡各15 g，丹参20 g组成，药材购自宜昌市中医院药房)；地高辛(上海上药信谊药厂有限公司，100片/瓶，0.25 mg/片，批号：020170909)。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)试剂购自美国Sigma公司；10%水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司。
3. 方法
3.1. 动物实验
3.1.1. 分组及给药
60只大鼠随机分为假手术、模型，芪苈山萸心衰方低(30 g/kg)、高剂量(60 g/kg)及地高辛组(9.0 × 10−5 g/kg)每组各12只，适应性喂养5 d后进行预处理。
3.1.2. 心梗后心衰模型的制备
参照周的方法 [12] ，应用线栓法制备心肌梗死后心力衰竭模型。术后第二天给各组大鼠进行灌胃给予相应的药物，假手术组和模型组灌胃给予等量的生理盐水，灌胃体积为10 ml/kg。每天一次，连续灌胃四周。
3.1.3. TTC染色确定心肌梗死体积
用PBS冲洗心肌残余的血液，吸取组织表面残余的水分，置于−20℃冰箱存放20 min，从心尖部至结扎部位下方制作连续切片，将切片放置37℃烘箱，0.2%的TTC溶液避光孵育30 min，后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，随后取出拍照。采用Image-pro plus 6.0图像分析软件计算大鼠的心肌梗死体积，计算梗死组织百分比(心肌梗死组织百分比 = 梗死区体积/心脏体积)。
3.1.4. 透射电镜检验细胞器损伤程度
PBS冲洗的心脏组织置于−20℃冰箱存放20 min，于梗死区域附近取一块体积约为1 mm3的心肌组织块，放置于2.5%戊二醛溶液保存以固定。用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗脑组织块3次后置于1%锇酸固定液中，在4℃条件下固定1 h。然后将组织块在梯度乙醇溶液中脱水并包埋在环氧树脂中，并在−80℃下聚合保存。用超薄切片机将组织块制作成60~70 nm厚的超薄切片，然后用3%柠檬酸铅染色，随后使用透射电子显微镜观察HF大鼠心脏细胞器损伤程度。
3.2. 网络药理学
3.2.1. 药物成分及靶点的收集
本研究采用中药系统药理学分析平台TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM平台(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)收集和筛选活性成分及对应的靶标蛋白，在Uniprot数据库(http://www.Uniprot.org/)查询靶标蛋白的基因名称，物种限制为“human”，并将靶标蛋白统一转换为基因名称保存。
3.2.2. 疾病靶点的筛选
在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和OMIM数据库(https://omim.org/)以关键词“Heart Failure”进行检索，收集HF相关靶蛋白。将药物预测靶点与疾病靶点的唯一值上传至生物信息学与进化基因组学网页工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析获得共有靶点。
3.2.3. 蛋白互作网络构建与分析
将共有靶点与疾病相关性得分取前100个靶点上传至STRIN (https://string-db.org/)在线分析平台，物种限制为“Homo sapiens”，获得蛋白互作网络图，将数据信息保存为“TSV”文件并导入到Cytoscape 3.7.2软件构建药物–成分–靶点–疾病网络，利用Network Analysis插件进行分析。
3.2.4. GO及KEGG富集分析
将筛选得到的作用靶点导入到DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)数据库，物种限定为“Homo sapiens”，输入靶基因名称，并设定阈值P < 0.05，进行GO和KEGG富集分析，并进行可视化处理。
3.3. 分子对接
从PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载排名前10化合物的2D结构，从RSCB PDB (http://www.rcsb.org)数据库下载排名前三的关键靶蛋白的3D结构。以关键靶蛋白PTGS1、CHRM1、CHRM3作为受体，以排名前10的化合物作为配体，利用AutoDock Tools 1.5.6进行分子对接。从各化合物对接结果的结合构象中，选取结合能较低且构象较好的对接结果。目前对于活性分子的靶点筛选尚无统一标准，研究报道结合能小于0说明配体与受体可以自发结合，小于−5说明配体与受体可以较好结合，因此这里选取结合能 ≤ 0 kJ/mol的成分作为筛选依据 [13] [14] [15] 。
3.4. 统计学分析
所有实验数据均采用SPSS 19.0统计软件处理，以均数±标准误(
)表示，各组数值比较采用单因素方差分析(ANOVE)，多组均数间的比较采用LSD法(方差齐性时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)，以P ≤ 0.05为差异有统计学意义。
4. 结果
4.1. 动物实验
4.1.1. 心脏组织梗死体积
TTC染色结果如图1所示，白色部分为心肌梗死区域，非白色部分为非梗死区域。统计结果如表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死体积显著增加(P < 0.01)。与模型组比较，低、高剂量组心肌梗死体积均显著减少(P < 0.05, 0.01)。
4.1.2. 心脏细胞器损伤程度
电镜结果如图2所示，正常组(A)线粒体完整；模型组(B)较正常组线粒体稀疏且数量明显减少，部分心肌细胞线粒体破裂且体积变小，线粒体嵴完全断裂，结构模糊不清；低剂量组(C)较模型组线粒体数量减少，肌原纤维结构比较完整，粗细均一，线粒体嵴部分断裂；高剂量组(D)较低剂量组线粒体结构比较正常，部分见线粒体减少；地高辛组(E)较药物组部分线粒体团聚，部分松散，伴有部分线粒体嵴断裂。
Figure 1. TTC staining results in each group rats with Heart Failure after Myocardial Infarction
图1. 心梗后心衰各组大鼠心脏组织TTC染色结果
Table 1. Myocardial infarction volume in each group
表1. 各组大鼠心肌梗死体积
(A) (B) (C)
(D) (E)
Figure 2. Transmission electron microscopy of organelle damage (20,000×)
图2. 心脏细胞器损伤程度的透射电镜图(20,000×)
4.2. 网络药理学
4.2.1. 药物成分、靶点及疾病靶点的筛选
利用TCMSP及BATMAN数据库筛选活性成分得到黄芪20个、葶苈子12个、山茱萸20个、北五加皮17个、大枣29个、桂枝7个、丹参65个，煅龙骨2个、煅牡蛎5个，筛除重复项后得到159个化合物，图3A；预测靶标共33,788个，整合删除重复项得到16,381个预测靶点。在GeneCards和OMIM数据库中筛选得到2743个疾病靶点，将药物预测靶点与疾病靶点取交集得到2136个交集靶点，图3B。芪苈山萸心衰方中部分活性成分(OB前30位的化合物)信息见表2。
4.2.2. 蛋白互作网络的构建
将共有靶点按相关性得分取前100上传至STRING在线分析平台，获得蛋白互作网络图，并将数据信息保存为“TSV”文件。将“TSV”文件导入到Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理，共得到100个节
Figure 3. Acquisition of drug ingredients and targets of Qilishanyu Heart Failure Prescription for the treatment of heart failure
图3. 芪苈山萸心衰方治疗心力衰竭的药物成分及靶点获取
Table 2. Information of part of active ingredients from Qilishanyu Heart Failure Prescription
表2. 芪苈山萸心衰方部分活性成分信息
续表
点，1483条边，图3C。借助Cytoscape 3.7.2软件中的“Network Analysis”插件进行拓扑分析，其中网络中关键性的参数是度值，在网络中节点的度值越大，则说明该节点在网络中的作用越强，度值越大，则气泡越大，可能是关键成分或靶点 [16] 。
4.2.3. 药物–成分–靶点–疾病网络构建与分析
运用Cytoscape 3.7.2软件构建药物–成分–靶点–疾病关系网络，图3D。该网络中共有181个节点，901条边。该网络分析结果显示，平均每个活性成分与8.5个靶点相互作用，平均每个靶点与3个活性成分相互作用。以节点度值的平均数作为筛选标准，筛选出大于等于平均度值的化合物和核心靶点，共得到20个核心化合物和82个核心靶点。其中排名前5的化合物分别为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、异鼠李素及木犀草素，分别与163、61、49、23、21个靶点相互作用；排名前3的靶点为山羊前列腺素内过氧化物合酶1 (Prostaglandin Endoperoxide Synthase 1, PTGS1)、毒蕈碱型胆碱受体M1 (Cholinergic Receptor, Muscarinic 1, CHRM1)、毒蕈碱型胆碱受体M3 (Cholinergic Receptor, Muscarinic 3, CHRM3)，分别能与61、48、42个活性化合物相互作用。
4.2.4. GO和KEGG富集分析
将药物–成分–靶点–疾病网络中涉及的82个核心靶点导入到DAVID数据库进行GO功能富集分析，得到GO条目588个(P < 0.01)。其中生物过程(GOBP)条目452个，细胞成分(GOCC)条目59个，分子功能(GOMF)条目77个，图4。结果显示芪苈山萸心衰方治疗心梗后心衰主要与胆固醇逆向转运、磷脂流出、细胞对脂多糖的反应等过程密切相关。
KEGG通路富集筛选得到37条信号通路(P < 0.05)，选取前15个通路绘制气泡图并对其进行通路分析，见图4。可见参与的主要通路有磷脂酰肌醇3-激酶–丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)信号通路、低氧诱导因子-1 (HIF-1)信号通路和激活受体(PPAR)信号通路等生物信号通路，此外，所有通路均涉及IL6。
(A) (B)
(D) (E)
Figure 4. Gene ontology molecular function (A), Gene Ontology Cellular Constituent (B), Gene Ontology Biological Process (C) and KEGG pathway enrichment analysis (D)
图4. 分子功能(A)、细胞成分(B)、生物过程(C)和KEGG通路富集分析(D)
(A) (B) (C)
Figure 5. Molecular docking of stigmasterol (A), beta-carotene (B) and hederagenin (C) with PTGS1
图5. 豆甾醇(A)、β-胡萝卜素(B)、常春藤皂苷元(C)与PTGS1的分子对接
Table 3. Binding energy of key compounds with core target proteins
表3. 核心化合物与关键靶蛋白的结合能
续表
4.3. 分子对接
一般认为配体与受体相互作用的亲和力越强，所需能量越少，发生作用的可能性越大。将芪苈山萸心衰方在“药物–成分–靶点–疾病”网络中的节点度值排名前10位的活性化合物与排名前3的靶蛋白分别进行分子对接，结果见表3。结果显示这10个化合物与3个靶蛋白之间的结合能均低于0 kJ/mol，表明其核心化合物与这3个靶蛋白均可以自发结合。其中，豆甾醇与PTGS1结合活性最好(结合能−5.42 kJ/mol)。结合活性前三位结果见图5。
5. 讨论
现代医学认为心肌梗死发生之后会引发一系列炎症反应，从而诱发心室重构，降低心功能状态，心肌细胞凋亡，病情恶化，引发心力衰竭，影响预后 [17] [18] [19] 。传统医学将心力衰竭归于“胸痹”“水肿”“痰饮”等范畴，其病机多为阳虚水泛、络淤水停，宜采取“温阳、利水”等的治法 [20] [21] 。芪苈山萸心衰方具有益气温阳、通络等功效，能够促进血液循环，增强心肌收缩力，降低心肌梗死的风险 [22] 。但是此前尚没有文献报道其关键靶点及信号通路，因此，本研究主要是基于网络药理学及分子对接并通过动物实验验证探讨芪苈山萸心衰方治疗心梗后心衰的潜在物质基础及作用机制。
动物实验TTC染色结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死体积显著增加(P < 0.01)。与模型组比较，低、高剂量组心肌梗死体积均显著减少(P < 0.05, 0.01)。电镜结果显示芪苈山萸心衰方可以改善受损的线粒体和肌原纤维结构，减轻心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌细胞器损伤。先前Nobutoshi Matsumura等通过动物实验发现抑制心脏毒性的代谢产物可以改善心肌梗死引起的心力衰竭，研究报道大约有40%的心力衰竭与心肌梗死相关 [23] 。在本研究中我们结合动物实验同样发现芪苈山萸心衰方对心肌梗死可能有较好的治疗作用，缓解由心肌梗死诱导的心室重构，从而达到改善心功能、治疗心衰的作用。
网络药理学结果显示，芪苈山萸心衰方中筛选的活性成分共有159个，16,381个潜在靶点，通过Cytoscape 3.7.2软件中的“Network Analysis”插件进行拓扑分析并依据度值确定了20个核心化合物和82个核心靶点，体现了中药具有多成分、多靶点的治疗特点。根据药物–成分–靶点–疾病网络，显示排名前5的化合物分别为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、异鼠李素及木犀草素，提示对改善心功能、治疗心衰具有积极作用。将评分较高10种化学成分分别与排名前三的靶蛋白PTGS1、CHRM1及CHRM3进行分子对接，结果显示可以自由结合，且豆甾醇和PTGS1结合较好，综合对三种核心靶蛋白的结合能力，表明芪苈山萸心衰方中豆甾醇、β-谷甾醇、β-胡萝卜素、常春藤皂苷元及紫丹参萜醚A可能为潜在的治疗心梗后心衰的活性成分，进一步证实了网络药理学的成分筛选结果。
根据药物–成分–靶点–疾病网络结果，芪苈山萸心衰方治疗心梗后心衰主要有细胞因子(IL-6)，前列腺素G/H合酶(PTGS1和PTGS2)，毒蕈碱胆碱受体(CHRM1, CHRM3)等82个核心靶基因，对这82个关键靶基因进行GO分析，发现可参与血小板脱颗粒、凝血功能等生物学过程。先前研究表明凝血酶刺激血小板可诱导血管内皮细胞生长因子(VEGF)的时间依赖性释放，调节炎症反应，可缓解心肌再灌注损伤，起到保护心肌细胞的作用 [24] [25] [26] 。KEGG结果显示PI3K-Akt、HIF-1、PPAR通路与HF相关，其中靶点富集数目较多的通路是PI3K-Akt信号通路。研究涉及的通路大多涉及IL-6基因，IL-6是一种调节急性期反应、炎症和造血等许多过程的细胞因子，心衰发生后会激活免疫系统，此时IL-6通过趋化炎症细胞聚集导致持续的炎症生物反应，进而损伤心肌细胞 [27] [28] 。先前已有研究表明PI3K-Akt是心肌肥厚过程中的一个重要的信号通路，由生理肥大引起的Akt的短期激活可能具有心脏保护作用，但可导致轻度心脏增大，Akt的长期激活加速了病理性心肌肥厚和纤维化，最终导致心力衰竭 [29] [30] [31] 。HIF-1可能在慢性疾病如心力衰竭、神经退行性疾病或癌症中起到重要作用，HIF-1在缺氧过程中是关键的调节因子，介导细胞凋亡，导致心肌细胞缺血再灌注损伤后死亡 [32] 。PPAR信号通路调控的关键酶参与心肌细胞的脂质代谢和糖代谢，通过调节和优化能量代谢从，在调节心血管效应方面发挥重要作用 [33] [34] 。以上结果提示芪苈山萸心衰方可能通过阻断心肌纤维化、对抗心肌梗死后血管炎症、细胞凋亡及调节能量代谢等方面治疗心梗后心衰。
分子对接结果显示，芪苈山萸心衰方中的核心化合物与关键靶蛋白PGTS1、CHRM1、CHRM3结合能均小于0 kJ/mol，表明芪苈山萸心衰方中的核心活性化合物与这3个靶蛋白可以自发结合。其中，豆甾醇与PGTS1结合活性较好(结合能为−5.42 kJ/mol)。先前研究发现PTGS1为槲皮素、木犀草素、异鼠李素等活性成分的潜在作用靶点，可以缓解心肌梗死后心肌间质和血管周围纤维化，并且可以减少心肌梗死面积，减轻左心室心肌细胞肥大，对保护心血管系统就具有积极意义 [35] [36] 。CHRM1和CHRM3是活性成分常春藤皂苷元的潜在作用靶点，在对抗炎症反应和保护心血管系统方面有重要作用，但其具体作用机制尚未详细报道 [21] [37] 。通过分子对接研究结果可以推测，芪苈山萸心衰方中核心化合物可能通过与核心靶蛋白结合降低炎症反应诱发心室重构的可能性，对抗细胞凋亡，调节心输出量，从而缓解心肌梗塞诱发的心力衰竭，但其具体机制有待于进一步研究。
6. 结论
综上所述，本研究应用网络药理学方法和分子对接技术并结合动物实验对芪苈山萸心衰方治疗心梗后心衰的药物活性成分、作用靶点及信号通路进行了分析研究，表明芪苈山萸心衰方治疗心梗后心衰是通过多成分、多靶点、多通路的协同作用来发挥疗效的，对临床用药具有指导意义。
基金项目
基于IL-6/JAK2/STAT3信号通路探讨附子理中汤对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其对肿瘤微环境的影响(ZY2023M038 面上项目)；主持三峡大学医学院创新创业重点项目(No.202108)一项。