非小细胞肺癌患者Th17细胞、血清IL-17、MMP2的表达在临床病理分期及淋巴结转移的诊断价值

The Diagnostic Value of Th17 Cells, Serum IL-17, and MMP2 Expression in Clinical Pathological Staging and Lymph Node Metastasis in Non-Small Cell Lung Cancer Patients

摘要: 目的：探讨Th17细胞、血清白细胞介素-17 (IL-17)、基质金属蛋白酶(MMP2)在非小细胞肺癌(NSCLC)临床分期及淋巴结转移中的临床应用价值。方法：选取2022年11月~2023年10月入住于陕西省人民医院的42例NSCLC患者(NSCLC组)及40例肺良性病变患者(对照组)，采用流式细胞术检测各组外周血Th17细胞水平，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中IL-17和MMP2水平，评估这三个检测指标在NSCLC临床分期和淋巴结转移中的应用价值及三者联合检测的诊断效能。结果：NSCLC组中，与I~II期患者对比，III~IV期患者外周血Th17细胞水平明显增高，血清IL-17和MMP2水平也明显较高，差异均有统计学意义(均p < 0.05)；NSCLC组中，淋巴结转移者Th细胞水平、血清IL-17和MMP-2水平与未转移者对比，明显较高，差异均有统计学意义(均p < 0.05)；Th17，IL-17和MMP2三项联合检测准确度、特异度、灵敏度分别为95.71%，93.84%和97.22%，与单项检测对比，均明显较高，差异均有统计学意义(均p < 0.05)。结论：Th17细胞，IL-17和MMP2在NSCLC与NSCLC临床分期及淋巴结转移中有一定关联，三者联合检测，有助于NSCLC的鉴别诊断。

Abstract: Objective: To explore the clinical application value of Th17 cells, serum interleukin-17 (IL-17), and matrix metalloproteinases (MMP2) in the clinical staging and lymph node metastasis of non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: 42 NSCLC patients (NSCLC group) and 40 patients with benign lung lesions (control group) admitted to Shaanxi Provincial People’s Hospital from November 2022 to October 2023 were se-lected. Flow cytometry was used to detect peripheral blood Th17 cell levels in each group, and en-zyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure IL-17 and MMP2 levels in the se-rum. The application value of these three detection indicators in clinical staging and lymph node metastasis of NSCLC, as well as the diagnostic efficacy of their combined detection were evaluated. Results: In the NSCLC group, compared with patients in stages I~II, patients in stages III~IV showed a significant increase in peripheral blood Th17 cell levels, as well as significantly higher serum IL-17 and MMP2 levels, with statistical significance (all p < 0.05); in the NSCLC group, the levels of Th cells, serum IL-17, and MMP-2 were significantly higher in patients with lymph node metastasis compared to those without metastasis, and the differences were statistically significant (all p < 0.05); the accuracy, specificity, and sensitivity of the combined detection of Th17, IL-17, and MMP2 were 95.71%, 93.84%, and 97.22%, respectively. Compared with single detection, they were significantly higher, and the differences were statistically significant (all p < 0.05). Conclusion: Th17 cells, IL-17, and MMP2 are associated with clinical staging and lymph node metastasis in NSCLC, and their combined detection can help in the differential diagnosis of NSCLC.

1. 引言

肺癌是公认的发病率高、预后差的恶性肿瘤，对人类的生命健康构成了巨大的威胁 [1] 。每年死于肺癌的人数预计在160万人左右，其中有85%的肺癌在组织学上的分类为非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)，由于NSCLC早期无典型症状及体征，发现及确诊时已到中晚期 [2] 。目前NSCLC治疗的主要策略包括手术、放疗和化疗。手术和放疗通常用于切除肿瘤病灶，而化疗在临床实践中主要作为术后辅助治疗 [3] ，但适宜手术治疗者仅为20%~30%，术后仍有60%患者存活不满5年，追其原因是25%~50%的病例会在疾病转归过程中发生转移 [4] 。因此，在临床分期和转移前提高诊断率，简化诊断方式，推广无创有效的诊断方法对NSCLC患者的早期诊断、预防治疗等有重要意义。

近年的研究中发现一种新型的CD4⁺效应T细胞即Th17细胞参与了恶性肿瘤的病理发展过程 [5] 。白细胞介素-17 (interleukin-17, IL-17)是一种前炎性细胞因子，由Th17细胞分泌，具有很强的募集中性粒细胞、促进炎性因子释放作用，通过与IL-17受体结合，使下游基因表达细胞因子 [6] ，且可通过Th17参与细胞免疫，IL-17与肿瘤的发生发展密切相关 [7] 。有科学家在鼠模型体内发现，IL-17等Th17细胞相关因子可能参与了NSCLC的发生发展过程 [8] 。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP)中的MMP-2是机体中主要的IV型胶原降解酶，在肿瘤的形成过程中起重要作用 [9] 。本研究拟探讨Th17细胞、IL-17、MMP2在NSCLC临床分期及淋巴结转移中的临床应用价值，及评估三者联合检测的效能。

2. 材料与方法

2.1. 研究对象

选取陕西省人民医院2022年11月~2023年10月经病理检验确诊的42例NSCLC患者(NSCLC组)及40例肺良性病变患者(良性病变组)为观察对象。NSCLC组纳入标准 [10] ：① 患者符合NSCLC诊断标准，且经病理检验确诊；② 患者心、肝、肾、胃功能正常；③ 入组前未接受相关放疗、化疗、免疫治疗；④ 预计生存期超3个月；⑤ 患者临床资料完整。NSCLC组排除标准：① 临床资料不全者；② 患有慢性阻塞性肺病、支气管哮喘等急慢性感染。③ 伴多发性硬化症、红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病；④ 并发其他恶性肿瘤；⑤ 妊娠期、哺乳期女性。NSCLC组：男性30例，女性12例，年龄22~65岁，平均年龄48.03 ± 5.14岁。腺癌28例，鳞癌14例。TNM分期：I期8例，II期12例，III期15例，IV期7例。淋巴结转移：有27例，无15例。良性病变组患者入组前均经CT与病理确诊，排除癌前病变，男性22例，女性18例，年龄27~65岁，平均年龄46.14 ± 4.28岁。两组患者性别、年龄对比差异无统计学意义(p > 0.05)，有可比性。以上患者均知情同意并经陕西省人民医院伦理委员会批准。

2.2. 仪器与试剂

采用流式细胞术检测各组外周血Th17细胞水平，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中IL-17和MMP2水平，ELISA试剂盒由武汉伊莱瑞特有限公司提供，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.3. 方法

流式细胞检测：空腹抽取患者每人肘静脉血6 ml，其中肝素抗凝血3 mL，用于流式细胞检测；促凝剂处理的血液3 mL，用于ELISA检测。肝素抗凝血采用淋巴细胞分离液密度梯度离心(2000 r/min离心20 min)分离单个核细胞。每组取5 × 10⁴细胞移入至流式管，向流式管中加入荧光抗体FITC-CD3和PerCP-CD4各10 μL，室温避光反应15 min。1500 r/min速率离心5 min，弃上清。在沉淀中加入Fixation/pormeabilization破膜剂1 mL，混匀室温放置20 min。加入PBS洗液2 mL，1500 r/min速率离心5 min，弃去上清液，留下沉淀。加入10 μL荧光标记的PE-IL17进行细胞内染色，避光反应30 min。加入PBS洗液2 mL，1500 r/min速率离心5 min，弃去上清液，留下沉淀。如此重复洗涤两次后，加入500 μL PBS重悬细胞进行流式检测。

ELISA检测：促凝剂处理的血液常温静置2 h，按2500 r/min离心10 min，分离血清。配置不同浓度标准品，然后将标本和不同浓度标准品加入相应板孔，再加入相应的生物标记素进行标记，置于37℃孵育60 min。洗板4次后，分别加入抗人IL-17和MMP2生物素化的抗体进行反应，37℃孵育60 min，加入特异性酶溶液作用后洗板，加入显色液终止反应，测其OD值，通过绘制标准曲线计算得出IL-17和MMP2的含量。

2.4. 观察指标

观察指标如下：① 比较Th17，IL-17和MMP2在NSCLC组和良性病变组中的表达。② 比较NSCLC组内I~II期和III~IV期患者Th17、IL-17和MMP表达情况。③ 比较NSCLC组内淋巴结转移和无转移患者Th17、IL-17和MMP2表达情况。④ 计算Th17、IL-17和MMP2单项诊断及三项联合诊断准确度、特异度、敏感度，其中准确度 = (真阳性 + 真阴性)/总例数 × 100%；灵敏度 = 真阳性/(真阳性 + 假阴性 × 100%。特异度 = 真阴性/(真阴性 + 假阳性) × 100%。

2.5. 统计学分析

将研究数据纳入SPSS22.0统计学软件中，计数资料用百分率(%)表示，使用χ²检验；计量资料用均数 ± 标准差(x ± s)表示，使用方差分析进行组间比较，经t检验，p < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

1) NSCLC组和良性病变组血清CA724，NSE和PGR水平比较见表1。NSCLC组患者CA724，NSE和PGR水平与肺良性病变组对比，两组间差异均具有统计学意义(p < 0.05)。

Table 1. Comparison of Th17, IL-17 and MMP2 levels between NSCLC group and benign lesion group (x ± s)

表1. NSCLC组和良性病变组患者Th17、IL-17和MMP2水平比较(x ± s)

2) 不同NSCLC临床病理分期患者Th17、IL-17和MMP2水平比较见表2。NSCLC组中，III~IV期患者血清CA724，NSE和PGR水平与I~II 期患者比较，两组间差异具有统计学意义(p < 0.05)。

Table 2. Comparison of Th17, IL-17 and MMP2 levels in patients with different clinicopathological stages of NSCLC (x ± s)

表2. 不同NSCLC临床病理分期患者Th17、IL-17和MMP2水平比较(x ± s)

3) NSCLC淋巴结转移组患者与无淋巴结转移组患者血清Th17、IL-17和MMP2水平比较见表3。NSCLC组中淋巴结转移组患者Th17、IL-17和MMP2水平与无淋巴结转移组患者比较，两组间差异具有统计学意义(p < 0.05)。

Table 3. Comparison of Th17, IL-17 and MMP2 levels between NSCLC lymph node metastasis group and non-lymph node metastasis group (x ± s)

表3. NSCLC淋巴结转移组与无淋巴结转移组Th17、IL-17和MMP2水平比较(x ± s)

4) Th17、IL-17和MMP2单项及三项联合诊断效能比较见表4。Th17、IL-17和MMP2联合诊断准确度、特异度、灵敏度与单项检测比较，两组间差异有统计学意义(p < 0.05)。

Table 4. Comparison of accuracy, specificity and sensitivity of Th17, IL-17 and MMP2 single and combined detection (%)

表4. Th17、IL-17和MMP2单项及三项联合检测准确度、特异度、灵敏度比较(%)

4. 讨论

NSCLC是一种临床常见的肺部恶性肿瘤，占所有肺癌的80%，具有高发病率和病死率特点 [11] ，且近年来呈上升趋势，严重影响患者生命健康 [12] 。目前手术切除、放疗、化疗和联合治疗作为NSCLC的主要治疗手段，显著提高了NSCLC患者的生存率 [13] 。然而，NSCLC发病隐匿，早期临床体征不明显，由于缺乏有效的早期诊断标记物，往往确诊时已进入中晚期，且25%~40%的病例会在疾病转归过程中发生转移 [14] 。目前，临床症状和影像学检查对于微小病灶等的检出效果较一般，仅60%~70%，病理学检查为诊断金标准，但有一定创伤性 [15] ，因此，开发NSCLC早期的诊断性生物标志物和治疗靶点尤为重要。

本研究中，我们通过流式细胞术检测NSCLC和肺良性病变患者外周血Th17细胞水平，结果显示NSCLC患者外周血中Th17细胞水平明显高于良性病变组，且在NSCLC组中，III~IV期及淋巴结转移患者Th17细胞水平明显升高。这表明Th17细胞容易趋化到肺癌组织内，且在肺癌组织局部呈高表达。有研究发现肿瘤细胞与肿瘤成纤维细胞能分泌趋化因子RANTES与单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)，诱导Th17细胞在肿瘤局部聚集增殖 [16] ；此外，肿瘤微环境中肿瘤细胞会分泌一些促进Th17细胞增殖所需要的细胞因子，这对Th17细胞的分化有着至关重要的促进作用，其中以分泌的IL-17最常见 [17] 。这验证了本研究中IL-17结果，即NSCLC患者外周血中IL-17水平明显高于良性病变组，且在NSCLC组中，III~IV期及淋巴结转移患者IL-17水平明显升高。IL-17与炎性反应和免疫活动有密切关系，有学者认为IL-17可能通过趋炎反应促进局部肿瘤的血管生成及侵袭转移，也可诱导PI3K/AKT通路 [18] ，使抗凋亡 [19] 、促血管生成等基因的表达上调 [20] ，促肿瘤发生发展。

MMP2与肿瘤的浸润和转移密切相关，由肿瘤细胞和间质细胞分泌，参与降解3型胶原、纤维黏连蛋白等胞外基质成分 [21] 。肿瘤细胞的持续性生长和转移均有MMP2的参与，MMP2是肿瘤新生血管形成的关键 [22] ，其可促进VEGF的表达 [23] ，从而使血管内皮细胞增殖，使血管通透性增加 [24] ，使血管内皮细胞外基质降解，进而为血管生长及延伸提供基础 [25] 。这完全解释了我们研究结果中NSCLC患者外周血中MMP2水平明显高于良性病变组，且在III~IV期及淋巴结转移患者中明显升高。

同时，本研究结果提示，Th17、IL-17和MMP2联合检测，在NSCLC诊断中的准确度、特异度及灵敏度分别95.71%、93.84%和97.22%，均明显高于单一检测，提示三种指标联合检测的诊断效能较好。

5. 结论

综上所述，Th17、IL-17和MMP2在NSCLC患者中表达异常，并能反映NSCLC临床分期及淋巴结转移程度，且三项联合检测具有较高诊断效能，可为NSCLC诊治提供可靠参考。

基金项目

陕西省人民医院科技发展孵化基金项目(2021YJY-29)，陕西省人民医院菁英人才项目(2021JY-48)。

NOTES

^*通讯作者。