1. 引言
什么是中药饮片？《中国药典》2010年版(一部)给出了明确的定义：饮片系指药材经过炮制后可直接用于中医临床或制剂生产使用的处方药品 [1] ，中药饮片来源多样，而且其加工运输和储存也很随意，这就使中药饮片非常容易受到微生物污染，并已影响到饮片自身和其衍生产品的质量和安全性 [2] 。
2020年版《中国药典》收载了大量的中药饮片品种，同时新增收载了1108“中药饮片微生物限度检查法” [3] ，但是相应的中药饮片微生物限度标准却还没有制订。
本研究以岭南地区6种常用中药饮片为对象，考察岭南地区常见的6种中药饮片的微生物污染情况，能够为我国其他地区中药饮片微生物污染控制提供示范性研究，为制定合理的中药饮片微生物限度标准提供数据支持。
2. 材料
2.1. 主要仪器
MIR-254-PC型生化培养箱松下。
1379型生物安全柜：Thermo。
microflex LRF型全自动快速微生物质谱鉴定系统：BRUKER。
2.2. 主要培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSB)，沙氏葡萄糖琼脂培养基(含氯霉素)，胰酪大豆胨液体培养基，沙氏葡萄糖液体培养基，肠道菌增菌液体培养基。
以上培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。
2.3. 样品的采集
本研究以砂仁、肉豆蔻、当归、巴戟天、广藿香、火炭母等六种岭南地区常用的中药饮片作为代表性样品，均为需煎煮中药饮片。本次共收集100批(样品信息详见表1)。
3. 方法
3.1. 微生物计数方法
本试验按照2020年版《中国药典》四部通则1108“中药饮片微生物限度检查法”对6种样品进行了微生物计数和控制菌检查。
3.2. 可疑菌鉴定
用IVD MALDI Biotyper全自动快速生物质谱检测系统程序对可疑菌进行鉴定。
4. 结果
Table 2. Test results of lgTAMC of samples
表2. 样品的lgTAMC检验结果
Figure 1. Box plot of lgTAMC of samples
图1. 样品lgTAMC箱线图
为了研究供试品的品种和使用部位对微生物污染量的影响，现将测定结果换算成lg值后对数据进行统计分析。
样品的lgTAMC值介于1.7~7.5，全部样品中均检出需氧菌总数，检出率为100%；lgTYMC值介于0.5~6.9，砂仁、当归、巴戟天的部分批次未检出霉菌和酵母菌，其余批次均检出了霉菌和酵母菌，检出率达到了85%；耐热菌总数lg值介于0.5~4.6，各个品种的部分批次检出耐热菌总数，检出率为38%。
不同品种TAMC的数据分析见表2。不同品种lgTAMC箱线图见图1。
不同品种TYMC的数据分析见表3。不同品种lgTYMC箱线图见图2。
Table 3. Test results of lgTYMC of samples
表3. 样品的lgTYMC检验结果
Figure 2. Box plot of lgTYMC of samples
图2. 样品lgTYMC箱线图
不同品种耐热菌总数的数据分析见表4。不同品种lg耐热菌总数箱线图见图3。
Table 4. Test results of lgNAIRE of samples
表4. 样品lg耐热菌总数
Figure 3. Box plot of lgNAIRE of samples
图3. 样品lg耐热菌总数箱线图
Figure 4. Microbial contamination in different parts of use
图4. 不同使用部位微生物污染量
图4分析结果表明不同品种、不同使用部位对微生物污染量测定结果是有显著影响的。使用部位为全草的的中药饮片广藿香和火炭母样本TAMC和TYMC测定结果均很高，分别达到107 cfu/g和106 cfu/g，分析原因可能与其药用部位本身有关，为全草入药，炮制方法为净制，只是经过挑拣清洗，去除非药用部位及杂质，这是造成其微生物污染量较高的原因。其他品种，果实入药的砂仁和肉豆蔻以及根茎入药的巴戟天和当归，微生物污染量测定结果比较相当。水浴(98~100℃)处理后的部分中药饮片的耐热菌总数仍然较高。
参照欧洲药典 [4] 、美国药典 [5] 和日本药局方 [6] 对中药饮片的微生物限度标准的规定(见表5)，对100批次中药饮片进行了评价，结果见表6。
Table 5. Microbial limit criteria of crude drug similar to Chinese herbal pieces in pharmacopoeia of other countries
表5. 各国的中药饮片微生物限度标准
TAMC和TYMC计数的最大允许值，以5倍因子计算。
Table 6. Unqualified rate of Chinese herbal pieces according to different limits
表6. 饮片参照不同计数标准的不合格率
100批次中药饮片中，沙门菌均没有检出，大肠埃希菌有4批次检出(火炭母1批，广藿香3批)，其中两批广藿香均为玉林本草堂中药饮片有限公司生产。耐胆盐革兰阴性菌的定量检查中，77批检出，最高污染程度达到了106 cfu/g。参照USP“干燥或粉末植物药材”的耐胆盐革兰氏阴性菌限度(不得过103 cfu/g)，不合格率高达42%。
在检查过程中，除了关注的沙门菌和大肠埃希菌之外，我们还从TSA平板、耐热TSA平板、控制菌检查MAC、XLD和紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上挑取可疑菌落进行鉴定，对上述平板上的菌落进行分离纯化，采用全自动微生物鉴定质谱仪进行菌种鉴定。耐热菌分离鉴定的结果主要为芽孢杆菌属，该属细菌的重要特性是能产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。芽孢是细菌的休眠体，在需氧和厌氧条件下均可生长，在适宜的条件下还可以重新转变成为营养态细胞。营养细胞的大量繁殖，会导致中药饮片腐败变质，从而影响中药的疗效。这同时说明了将微生物控制的方法仅仅寄托在服用前的加热处理是不够的，应该结合中药饮片的生产工艺，综合考虑药材的生产炮制过程、包装、储存等多方面因素。此外，本次研究中还鉴定出多种致病菌以及一些条件致病菌，如鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、克罗诺菌属，对以上检出的条件致病菌进行了保藏以待后续进行进一步研究。
5. 讨论
上海、北京、陕西、广西等地药检机构的研究表明我国中药饮片整体卫生水平较低，微生物负载较高 [7] [8] [9] [10] 。本研究对岭南地区常见的6种中药饮片的微生物污染状况进行了分析，建立了这六种饮片的微生物负载数据库，为《中国药典》增加中药饮片限度标准的制定提供了一定的数据积累。欧洲药典 [4] 、美国药典 [5] 和日本药局方 [6] 等各国药典虽然对中药饮片判断标准各不相同，但都对中药饮片的微生物限度标准提出了要求(见表5)，这也说明了各国对于中药饮片污染微生物数量大、种类多客观事实的认可，同时也提示需要进一部完善对中药饮片的微生物限度标准。建议通过梳理国外药典，根据“风险分级”的原则，设定不同的控制项目和限量，逐步完善国内饮片的微生物控制标准，通过标准促进企业进行饮片生产过程的微生物控制，从而提高饮片的质量进而推动中药行业的国际化。
基金项目
2020ZDB01广东省药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室——中药饮片污染微生物的风险评估与控制。
参考文献
NOTES
*通讯作者。