基于生物信息学、网络拓扑策略探究针刺干预帕金森病的中枢机制

Exploring the Central Nervous System Mechanism of Acupuncture for Parkinson’s Disease Based on Bioinformatics and Network Topology Strategies

摘要: 目的：运用文本挖掘、生物信息学、网络拓扑学等方法，探究针刺治疗帕金森病(PD)的多靶点中枢机制。方法：检索文献发现针刺后产生的活性化合物，通过STITCH和SwissTargetPrediction数据库预测潜在作用靶点。利用人类基因数据库、在线人类孟德尔遗传数据库和全球蛋白资源数据库筛选出PD相关的疾病基因靶点。运用Cytoscape3.10.1软件构建共有靶点蛋白质–蛋白质互作网络图，通过DAVID数据库对共有靶点分别进行基因本体富集分析和京都基因组百科全书富集分析并可视化。结果：共鉴定了114个与针刺治疗帕金森病相关的基因靶点，筛选了65条通路。结论：针刺治疗PD与刺激多巴胺分泌，减少多巴胺能神经元凋亡、调节5-羟色胺代谢水平、提高去甲肾上腺素水平、刺激神经营养因子、缓解炎症反应等密切相关。

Abstract: Objective: To investigate the multi-target mechanism of acupuncture for Parkinson’s disease (PD) using text mining, bioinformatics, and network topology. Methods: Literature was searched to dis-cover active compounds produced after acupuncture, and potential targets of action were predicted by STITCH and SwissTargetPrediction databases. PD-associated disease gene targets were screened using the Human Gene Database, the Online Human Mendelian Inheritance Database, and the Glob-al Protein Resources Database. Cytoscape3.10.1 software was used to construct protein-protein in-teraction network maps of shared targets, and gene ontology enrichment analysis and Kyoto Ge-nome Encyclopedia enrichment analysis of shared targets were performed and visualized by DAVID database, respectively. Results: A total of 114 gene targets related to acupuncture for Parkinson’s disease were identified, and 65 pathways were screened. Conclusion: Acupuncture therapy for PD is closely related to stimulating dopamine secretion, reducing apoptosis of dopaminergic neurons, regulating 5-hydroxytryptamine metabolism levels, increasing norepinephrine levels, stimulating neurotrophic factors, and alleviating inflammatory responses.

1. 引言

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是世界第二大神经退行性疾病，其病理特征是人体中脑黑质致密部(SNpc)的多巴胺(DA)能神经元变性 [1] 。研究表明2016年全球PD患者预计人数为620万，比1990年增加118% [2] 。目前，伴随人口老龄化，生活环境的变化，随着年龄的增长，我国PD发病率逐渐增加 [3] 。PD的临床表现是运动迟缓、僵硬、静止性震颤和姿势不稳等运动症状以及便秘、尿失禁、认知障碍、情绪障碍和睡眠障碍等非运动症状。目前PD的发病机制尚不明确，研究表明其可能与氧化应激、免疫炎性异常、线粒体功能障碍等诸多因素有关 [4] [5] 。左旋多巴是DA替代药物，常用于缓解PD运动症状，但随着疾病的进展和剂量的增加，其治疗作用逐渐受限且会出现心律失常、直立性低血压、恶心呕吐等不良反应 [6] [7] 。

针刺治疗PD疗效确切，能起到很好的治疗作用 [8] [9] [10] [11] [12] 。本课题组前期研究证明针刺可以促进α-突触核蛋白的自噬清除，提高SNpc中DA能神经元的活性，并在PD小鼠的行为水平上改善了运动功能 [8] 。一项网状荟萃分析指出，不同的针灸方法与传统治疗相结合改善PD运动症状 [9] 。多项临床试验报告称，针刺有助于改善PD患者运动症状，及非运动症状如疲劳、疼痛、便秘等，提高生活质量 [10] [11] [12] 。针刺防治PD的疗效显著，但其机制尚未阐明。在本研究中，笔者试从生物信息学、网络拓扑策略等方面，探究针刺治疗PD的主要中枢作用机制。

2. 资料与方法

2.1. 文献检索

在这项分析中，我们系统地检索了以下8个数据库：Web of Science、Cochrane Library、Embase、PubMed、CNKI、VIP、CBM和万方数据库，检索时限为2001年11月~2023年11月。检索方式为主题词检索。检索词为“acupuncture”“manual acupuncture”“electroacupuncture”“Parkinson’s disease”“central nervous system”“针刺”“体针”“电针”“帕金森病”“震颤麻痹”“颤症”“中枢”“中枢神经系统”“中枢系统”。

2.2. 纳入标准

毫针或电针治疗PD的随机对照试验；非随机前瞻性和回顾性试验；动物实验；对照组干预方式为安慰剂针、不干预或药物治疗。

2.3. 排除标准

干预方式为穴位按压、艾灸、经皮电刺激；以压痛点、敏感点而非标准穴位为进针部位；单组观察性研究；仅比较不同针刺方法的研究。

2.4. 文献筛选

由两名研究者参与，根据纳排标准各自检索数据库，只纳入全文版本文献。对于研究人员的争议部分，进行重复核对协商解决。

2.4.1. 针刺后机体产生活性成分的蛋白靶点筛选

从STITCH数据库(combined score > 0.95)和SwissTargetPrediction数据库(Probability > 0.1)中获得多巴胺(Dopamine, DA)、α-突触核蛋白(alpha synuclein, α-syn)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、去甲肾上腺素(Norepinephrine, NE)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)、肿瘤坏死因子-α (TNF-alpha, TNF-α)和白介素1 (Interleukin-1, IL-1)等8个针刺后活性成分的潜在作用靶点。通过EXCEL软件合并上述2个数据库的检索结果后去重，得到潜在作用靶点数据库。

2.4.2. 帕金森病疾病基因靶点的筛选

本研究以“Parkinson’s disease”为关键词检索了GeneCards数据库、全球蛋白资源数据库(UniProt)和在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)得到PD的疾病基因靶点，使用EXCEL软件合并上述3个数据库的检索结果并去重，得到PD基因靶点数据库。

2.4.3. 针刺抗PD相关靶点的筛选

将“针刺后活性成分靶点”与“PD基因靶点数据库”两组靶点用Venn工具 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行可视化分析。两组靶点的重叠部分即为针刺干预PD的潜在靶点。使用Cytoscape3.10.1软件绘制PD-活性成分–共有靶点网络图以明确针刺产生的活性物质与关键靶点之间的关系。

2.4.4. 蛋白质相互作用网络的构建

将共有靶点上传到STRING11.5 (https://string-db.org/cgi/input.pl)构建蛋白–蛋白互作网络(protein- protein interaction networks, PPI)。以智人(Homo sapiens)作为物种背景基因，获得共有靶点的PPI网络，将结果导入Cytoscape3.10.1软件进行可视化分析，以度值(Degree)作为节点重要性的主要观察指标，使用CytoHubba插件筛选出PPI网络中的Hub基因靶点。Top 20共有靶点按Degree排序，作为针刺治疗PD的关键靶点。

2.4.5. 基因本体论与京都基因组百科全书的富集分析

根据DAVID数据库获得共有靶点的基因本体(Gene Ontology, GO)功能注释和京都基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析数据，导入SRplot (https://www.bioinformatics.com.cn)绘制结果并将其可视化。

3. 结果

通过中英文数据库检索，共纳入58篇文献，筛选出24个相关的活性物质，其中DA、α-syn、5-HT、NE+、BDNF+、GABA、TNF-α、IL-1出现频次最高，可能对PD治疗有效 [13] - [20] 。

3.1. 针刺治疗帕金森病的靶点筛查

筛查结果发现针刺后活性成分所作用的基因257个；PD相关基因2997个。将人类基因代码标准化，绘制257个针刺后活性成分的潜在作用靶点和2997个PD疾病基因靶点的韦恩图，得出了114个共有靶点(图1)，即针刺治疗PD的潜在治疗靶点。“针刺–活性成分–靶点–疾病”互作网络见图2，橙色正六边形代表活性成分，红色椭圆形代表Degree值排名前25的潜在靶点，蓝色椭圆形代表其余潜在靶点，黄色菱形代表针刺治疗，黄色长方形代表帕金森病，节点的连接越多，相应的图形面积越大，在治疗中发挥的作用越明显，其中DA、α-syn、5-HT、NE+、BDNF+、GABA、TNF-α、IL-1在治疗过程中可能起到关键作用。

3.2. PPI网络的建立与分析

基于STRING数据库构建PPI网络，拓扑分析后，通过Cytoscape可视化，删去单独游离节点，共显示80个节点。网络中节点的连接数为“Degree”，可以反映节点之间的交互程度，当一个节点与其它节点的互作关系线越多时，Degree值越大。NGFR最大(12)，其次是PLCG1 (10)、APP (8)、CASP3 (8)、DBH (7)、COMT (7)、MAPK8 (7)、NTRK1 (7)和HLA-DRB1 (7)，详见图3。Top 20核心靶点按程度排序如表1所示。

Figure 1. Intersecting targets of Parkinson’s disease-related genes with genes related to active ingredients after acupuncture

图1. 帕金森病相关基因与针刺后活性成分的相关基因交集靶点

注：正六边形为活性成分，椭圆形为靶点。

Figure 2. PD-active ingredient-shared target network diagram

图2. PD-活性成分–共有靶点网络图

Figure 3. PPI network diagram of Top 20 core targets

图3. Top 20核心靶点PPI网络图

Table 1. Acupuncture therapy for PD core target degree values and names

表1. 针刺治疗PD核心靶点度值及名称

3.3. GO和KEGG富集分析

GO分析可以从3个层面反映靶标功能，分别为生物过程(biological process, BP)、细胞成分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)。共有靶点的GO分析结果显示得到628条生物学过程，其中BP有411条、CC有97条、MF有120条，按照-log10 (P value)由大到小的顺序，分别取富集丰富前10条目作图，见图4。

在BP水平，预测靶点主要参与化学突触传递、运动行为、G蛋白偶联受体信号通路等生物过程；在CC水平集中于质膜的组成部分、质膜和突触后膜等细胞结构；在MF水平，分子功能在相同蛋白结合、神经递质受体活性、多巴胺结合等条目所占比例更大(图4)。

共有靶点富集得到KEGG通路65条。图5列出了潜在靶点的KEGG富集排名前20的结果。KEGG信号通路涉及神经活性配体与受体的相互作用等功能通路，细胞凋亡、细胞凋亡–多种疾病等凋亡通路，帕金森病、多巴胺能突触等神经信号通路，钙信号通路、cAMP信号通路。图6总结了潜在靶点在Parkinson’s disease通路中的作用。

注：横坐标长度代表富集在该通路上的基因数量，颜色代表-log10 (P value)色温越高则富集程度显著性越高。

Figure 4. GO analysis of potential targets

图4. 潜在靶点的GO分析

注：横坐标长度代表富集在该通路上的基因数量，颜色代表-log10 (P value)色温越高则富集程度显著性越高。

Figure 5. KEGG enrichment analysis of potential targets

图5. 潜在靶点的KEGG富集分析

Figure 6. Schematic diagram of core targets and pathways

图6. 核心靶点及通路示意图

4. 讨论

帕金森病主要源于基底节功能障碍，基底节是一组相互连接的皮层下和脑干核，在调节运动的启动和顺利执行方面发挥着重要作用。具体而言，中脑黑质中多巴胺能神经元的丧失损害了向纹状体(尾状体加苍白球)的信号传导，PD患者确诊时，均有30%至50%多巴胺能神经元的丧失，且伴有更大比例的多巴胺能末梢功能失调，突触的丧失和/或轴突变性导致了最初的PD运动表现，除此之外，PD的形成广泛涉及多种交叉基因靶点相互作用。本文基于生物信息学及网络拓扑学筛选潜在靶点，预测针刺治疗PD、预防复发的关键作用靶点及信号通路。

本研究筛选出针刺PD后相关活性物质主要为DA、α-syn、5-HT、NE、BDNF、GABA、TNF-α、IL-1。α-syn的异常折叠和降解障碍是DA损伤的关键因素，在氧化应激与线粒体功能障碍等情况下α-syn皆会出现异常折叠，而生理上α-syn具有保护DA细胞参与合成的作用 [21] 。NE和5-HT能神经递质的下降与原发性抑郁相关，中脑–皮质–边缘叶DA径路功能障碍可以导致PD患者的抑郁和疲劳等非运动症状 [22] 。5-HT神经元的合成受到抑制加剧焦虑水平。PD患者缝合核神经元的退化伴随着前脑5-HT能神经支配的减少，导致中脑黑质中5-HT的合成和代谢过程异常 [23] 。在DA能神经元的存活、分化和生长过程中，BDNF发挥着重要作用，集中于神经元发育、信号转导、中枢神经系统可塑性调节等方面中 [24] [25] [26] 。5-HT与BDNF之间存在串扰，BDNF可以通过常见的细胞内信号通路控制彼此的功能 [27] 。GABA是一种重要的抑制性神经递质，GABA能神经元与DA能神经元密切关联，在基底神经节网络中对运动进行精确调节 [28] 。BDNF影响GABA能中间神经元的表型，后者反过来调节皮层回路的兴奋性，并最终通过BDNF依赖性机制调节皮层抑制 [27] 。神经系统内分布广泛神经炎症介导的神经毒性在PD神经元死亡中起到重要作用，TNF-α、IL-1β等细胞因子在PD患者炎症病理改变中发挥重要作用，主要表现为在PD患者DA神经元损害部位常多出现 [29] 。

通过文献筛选出“针刺–帕金森病”相关活性蛋白质后，分析出共同靶点，PPI蛋白互作网络结果表明，针刺干预PD具有多靶点、多通路的特点。针刺干预PD与114个靶点相关，其中度值最高的20个靶点中，10个与DA相关，5个与TNF-α相关，这与既往文献中DA与TNF-α在PD中发挥的重要作用相一致。NGFR位于核心靶点首位，并且有PLCG1、CASP3、MAPK8、COMT、MAO等靶点在核心靶点网络与KEGG通路富集分析中。NGFR与PLCG1均是DA相关基因。神经生长因子受体(Nerve Growth Factor Receptor, NGFR)即p75神经营养因子受体，是包括原神经生长因子、BDNF等哺乳动物神经营养素的低亲和力受体，它参与决定神经元存活和死亡的途径 [30] 。研究表明，NGFR/p75NTR结合的配体主要引起细胞凋亡信号通路的激活 [31] [32] 。NGFR可以调节轴突生长、细胞周期和突触可塑性 [33] 。动物实验表明，在左旋多巴诱导的运动障碍模型大鼠中，受损纹状体中NGFR显著增加，特异性敲低纹状体NGFR水平可以阻止运动障碍的发展并可增加纹状体结构的可塑性 [34] 。

磷脂酶Cγ1 (phospholipase C gamma 1 Gene, PLCG1)作为Parkin的新型底物，在大脑中高度表达并参与神经营养因子介导的神经元细胞功能，参与大脑发育和突触传递 [35] 。PLCG1的异常表达和激活出现在各种脑病中，如癫痫、抑郁症和阿尔茨海默病 [36] 。在钙信号通路中，表皮生长因子结合其膜上受体，激活PLCG1，释放游离甘油二醇(DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，后者与内质网上的1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)结合，使钙离子过量内流，调控钙调蛋白激活下游凋亡及MAPK信号通路。

在内质网钙离子失调引起的凋亡过程中，钙蛋白酶水解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12 (Caspase-12)产生活性更强的水解底物，剪切Caspase-3诱导细胞凋亡 [37] 。Caspase-3诱导凋亡是通过在细胞核内灭活DNA修复酶，干扰细胞能量代谢来实现的，与DA能神经元死亡密切相关 [37] 。研究表明凋亡在DA能神经元缺失过程中起到核心作用，抑制Caspase-3的激活从而阻止DA能神经细胞凋亡，是相关药物发挥对PD治疗作用的重要途径 [38] 。

丝裂原活化蛋白激酶8 (mitogen-mitogen-activated protein kinase, MAPK8)即JNK1，是JNK信号通路的重要基因。MAPK8与Caspase-3均是TNF-α相关基因，TNF-α可以通过Ha-Ras非依赖性方式激活JNK通路 [39] 。cAMP抑制TNF-α诱导的JNK活化，TNF-α诱导细胞死亡则依赖JNK活性，因此cAMP可以拮抗TNFα诱导的细胞凋亡。cAMP信号通路与JNK相关通路可调节细胞凋亡，磷酸化c-Jun可能与炎症反应关系密切并与PD发病密切相关 [40] [41] 。

单胺氧化酶(Monoamine oxidase, MAO)是一种黄素蛋白酶，分为MAO-A及MAO-B两种亚型，它们结合在线粒体外膜且均为5-HT相关基因，并对DA的突触内代谢起重要作用。MAO-A主要分布在儿茶酚胺能神经元中，MAO-B则主要分布于神经胶质细胞和组胺能神经元中。在多巴胺转运蛋白将DA重新摄取到突触前神经元中后，DA被MAO-A代谢或被VMAT2摄取到突触小泡中，通过抑制MAO-A的活性，提高神经内5-HT的浓度，可治疗焦虑症和抑郁症 [42] 。摄取到非DA能突触后神经元或胶质细胞后，DA将被MAO-B脱氨基，或被儿茶酚-O-甲基转移酶(Catechol-O-Methyltransferase, COMT)甲基化，然后脱氨基。该过程在多巴胺能突触通路中广泛存在，尤其多见于神经胶质细胞和突触前末端对DA的代谢 [43] 。抑制MAO或COMT可提高底部神经中枢中DA的浓度，治疗帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。

GO分析结果表明，针刺治疗PD的作用机制是广泛涉及多靶点、多信号通路的，包含多种生物学过程。其中BP层面涉及G蛋白偶联受体信号通路、化学突触传递，这与神经信号传递、Ca²⁺信号通路密切相关。在CC水平，涉及质膜和突触后膜皆与神经递质相关。本研究的KEGG富集分析结果将靶点富集的生物过程显示出来，表明针刺治疗PD与多巴胺能突触、神经营养素信号通路、cAMP信号通路、钙信号通路、炎症介质相关。

综上所述，本研究预测针刺可能通过NGFR、PLCG1、CASP3、MAPK8、COMT、MAO等关键靶点来调节多巴胺能突触、cAMP信号通路、钙信号通路、炎症介质等，从而增强DA分泌，减少DA能神经元凋亡、提高NE及5-TH代谢水平、增加神经营养因子的释放以治疗PD。本研究只纳入了针刺治疗后人体产生的8种活性物质，其他活性物质仍需进一步数据挖掘和实验验证，并且缺乏对研究结果的体外实验验证，且对于不同针刺条件下活性物质的分泌水平并未进行深入分析，缺乏更深入的数据挖掘。

针刺可以通过穴位刺激，广泛调控人体网络，发挥层次丰富、多靶点调控的特点，从而对PD起到治疗作用。笔者基于文献研究，借助生物信息学和网络拓扑学方法，研究针刺治疗PD的中枢机制，为针刺治疗PD的基础实验研究提供了理论依据，为临床研究提供了研究方向。

基金项目

上海市老龄化和妇儿健康研究专项(2020YJZX0134)，国家自然科学基金青年科学基金项目(82205260)。

NOTES

^*通讯作者。