摘要: 目的：通过复方巴戟天健骨颗粒中丹酚酸B质量控制研究，评价制剂质量。方法：色谱柱采用Sino Chrom ODS-BP (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)，流动相乙腈-0.1%磷酸水，等度洗脱，体积流量1.2 mL•min−1，柱温30℃，检测波长286 nm。结果：丹酚酸B在考察的浓度范围内线性关系良好(r = 1.000)，线性范围为8.25~165.00 μg/mL，平均加样回收率为99.16%，RSD为1.52%。结论：该方法操作简便、准确、重复性好，可为复方巴戟天健骨颗粒质量控制提供实验依据。
Abstract:
Objective: To evaluate the quality of the preparation through the quality control study of salvianolic acid B in Compound Morinda Jiangu Granules. Methods: The chromatographic column adopted Sino Chrom ODS-BP (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), and the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid water. Isocratic elution was used with a volume flow rate of 1.2 mL•min−1, a column tempera-ture of 30˚C, and a detection wavelength of 286 nm. Results: Salvianolic acid B had a good linear re-lationship within the investigated concentration range (r = 1.000), the linear range was 8.25~165.00 μg/mL, the average recovery rate was 99.16%, and the RSD was 1.52%. Conclusion: This method is simple to operate, accurate and reproducible, and can provide experimental basis for quality control of Compound Morinda Jiangu Granules.
1. 引言
复方巴戟天健骨颗粒是源于临床验方“复方巴戟天合剂”开发制成的特色医疗机构中药制剂，临床用于治疗股骨头坏死疗效显著 [1] [2] [3] 。该制剂由巴戟天、丹参、三七、郁金、枸杞子、骨碎补、补骨脂、淫羊藿、续断、木瓜、党参、黄芪十二味中药组成，其中巴戟天为君药，具有补肾阳、壮筋骨之功效；丹参、三七、郁金为臣药活血化瘀；佐以骨碎补、补骨脂、淫羊藿、续断、枸杞、木瓜，增强补益肝肾、强筋壮骨、祛风除湿作用；党参、黄芪为使药，具有益气作用，“气行则血行”，“通则不痛”，诸药合用，标本兼治，共奏活血化瘀、补益肝肾、壮骨止痛之功 [4] [5] 。前期我们已对提取工艺进行优化，确定了最佳水提工艺参数 [6] ，为了更全面地体现制剂质量，在原有质量标准的基础上进行了升级研究 [7] ，并对包括丹酚酸B在内的6个化学成分进行了含量测定。丹酚酸B是丹参的主要成分，也是制剂中含量最高的成分，因此实验抽取7个批次的复方巴戟天健骨颗粒，以丹酚酸B为指标，评估制剂的整体质量。
2. 实验材料
2.1. 仪器
Dionex U3000高效液相色谱仪–二极管阵列检测器(美国Thermo Fisher Scientific公司)；SCLEAE01超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；EX125ZH电子天平[奥豪斯仪器(常州)有限公司]；超纯水制造设备(四川卓越水处理设备有限公司)。
2.2. 试药
对照品丹酚酸B (批号S29GB162878，纯度 ≥ 98%)购自上海源叶生物科技有公司，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。7批次复方巴戟天健骨颗粒(批号分别为202202006、202206016、202208006、202209006、202301002、202304012、202308002；规格为12 g/袋)与缺丹参阴性样品均由福建中医药大学附属第二人民医院制剂中心提供。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
采用SinoChrom ODS-BP色谱柱(4.6 × 250 mm, 5 μm)，流动相乙腈-0.1%磷酸水(22:78)，等度洗脱，柱温为30℃，流速为1.2 mL/min，检测波长为286 nm，进样量为10 μL。
3.2. 溶液制备
3.2.1. 对照品溶液制备
取丹酚酸B对照品粉末适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.65 mg/mL的对照品母液，其他不同浓度的溶液由80%甲醇稀释得到。
3.2.2. 供试品溶液制备
取本品约1 g，精密称定，置于50 mL具塞瓶中，精密移入80%甲醇10 mL，称重，超声(功率250 W，频率50 kHz)处理30 min，再次称重，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
3.2.3. 阴性样品溶液
按本品处方工艺和比例，制成缺丹参的阴性样品，按“3.2.2”项下方法制备，即得。
3.3. 专属性试验
取丹酚酸B对照品、复方巴戟天健骨颗粒供试品、缺丹参阴性样品溶液，在“3.1”项的色谱条件下进样分析，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰保留时间一致且分离完全，阴性无干扰，符合定量分析要求，表明该方法专属性良好。
A. 对照品；B. 复方巴戟天健骨颗粒样品；C. 缺丹参阴性；1. 丹酚酸B。
Figure 1. HPLC spectrum of compound Morinda Jiangu Granules
图1. 复方巴戟天健骨颗粒HPLC图谱
3.4. 线性关系考察
分别精密吸取“3.2.1”项下的对照品溶液适量，用80%甲醇稀释成梯度浓度的对照品溶液，在“3.1”项色谱条件下进样分析。以对照品的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得到丹酚酸B的回归方程为：Y = 0.1099X − 0.0319 (r = 1.000)，线性范围为：8.25~165.00 μg/mL，可知在设定范围内线性关系良好，见图2。
Figure 2. Salvianolic acid B standard curve chart
图2. 丹酚酸B标准曲线图
3.5. 精密度试验
精密吸取“3.2.1”项下对照品溶液适量，在“3.1”项条件下1天内连续进样6次及连续3天重复进样(3次/天)测定，记录成分的峰面积，分别计算峰面积比的RSD，日内与日间精密度的RSD分别为0.17% (n = 6)、0.93% (n = 9)，表明仪器精密度良好。
3.6. 稳定性试验
取“3.2.2”项下复方巴戟天健骨颗粒供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24 h在“3.1”项条件下进样分析，记录各时间点丹酚酸B峰面积，计算峰面积RSD为0.31%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
3.7. 重复性试验
取同一批复方巴戟天健骨颗粒6份(批号：202308002)，按“3.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，在“3.1”项条件下进样分析，测得6份样品所含丹酚酸B的质量分数分别为0.1061%、0.1079%、0.1076%、0.1088%、0.1077%、0.1067%，计算其RSD为0.85%，表明该方法重复性良好。
3.8. 加样回收率试验
Table 1. Salvianolic acid B recovery rate test
表1. 丹酚酸B回收率试验
精密取已知含量的复方巴戟天健骨颗粒9份(批号：202308002)，每份约0.5 g，分为3组，3份/组，组间按样品中已知含有量/加入量约1:0.5，1:1，1:1.5设低、中、高3水平。精密加入丹酚酸B对照品，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“3.1”项条件下进行分析，计算回收率，见表1，结果丹酚酸B平均回收率为99.16%，RSD值为1.52%，表明该方法准确性高。
3.9. 样品含量测定
取7批次复方巴戟天健骨颗粒样品，按“3.2.2”项下方法制备，在“3.1”项条件下进行测定，记录丹酚酸B的峰面积，代入“3.4”项下的回归方程计算含量，结果见表2，图谱见图3。
Table 2. Content determination results of 7 batches of Compound Morinda Jiangu Granules (n = 3)
表2. 7批次复方巴戟天健骨颗粒含量测定结果(n = 3)
Figure 3. HPLC chromatograms of 7 batches of Compound Morinda Jiangu Granules
图3. 7批次复方巴戟天健骨颗粒HPLC图谱
4. 结果与讨论
1) 丹参是复方巴戟天健骨颗粒的主要药味，现代药理表明，其具有抗血小板聚集、扩张血管等作用 [8] 。丹参主要化学成分包括水溶性成分丹酚酸类和脂溶性成分丹参酮类，其中丹酚酸类以丹酚酸B单体含量最高 [9] 。2020版药典中丹参项下对包括隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的总量以及丹酚酸B进行含量测定 [10] ，由于复方巴戟天健骨颗粒中丹参药材制备工艺为水提，所以脂溶性成分丹参酮类提取率较低，采用常规液相检测难度大，且丹参配方颗粒国家标准(批准文号：YBZ-PFKL-2021035)中也只对丹酚酸B的含量进行规定。结合丹酚酸B在复方巴戟天健骨颗粒含量最高，因此，选用其作为指标性成分对制剂整体质量进行评估。
2) 实验对7批复方巴戟天健骨颗粒中的丹酚酸B的含量进行测定，平均含量为10.4772 mg/袋。不同批次间丹酚酸B的含量存在一定差异，其中202202006、202206016、202208006批间差异较小，RSD为0.23%；202301002批次丹酚酸B含量最低，202308002含量最高。实验前期以丹酚酸B等三种有效成分含量和干膏得率的加权评分为综合指标，结合正交试验研究复方巴戟天健骨颗粒的水提工艺，确定了最佳参数 [6] 。生产期间，严格按照配方投料，并按照工艺参数进行生产配制，考虑丹参原料药材对于制剂的整体质量影响较大。不同批次的原料药产出的浸膏存在一定差异，对于后续辅料的加入量造成影响，进而导致不同批次间指标性成分的差异性。既往文献报道：粟华生等 [11] 对不同种植方式、生产方式、产地与种植年限的丹参药材进行研究，发现丹酚酸B的含量范围分别为4.70%~6.79%、0.46%~9.81%、4.70%~11.2%与1.13%~4.66%，结果表明其含量差异较大，相关文献也报道了由于各种条件因素(如不同炮制工艺等)导致丹参药材中丹酚酸B含量存在差异 [12] [13] ，其中发现河南产区含量较高 [14] [15] 。提示我们在生产过程中，尽量选择河南产区来源的中药饮片作为原料药。此外需加强对中间品的质控，可采用HPLC法对中间品中的指标性成分含量进行测定，尽可能缩小批间差异。
5. 小结
如何保证制剂均一、稳定一直是医疗机构中药制剂研究的关键，本实验所建立的HPLC法可准确对复方巴戟天健骨颗粒中丹酚酸B进行定性和定量，可为该制剂的质量控制和评价提供数据支持。
基金项目
项目来源：1) 福建省医疗机构中药制剂重点实验室(福建中医药大学)；2) 福建省高校产学合作项目(项目编号：2023Y4010)。