化疗联合改良供者淋巴细胞输注并阿扎胞苷维持治疗异基因造血干细胞移植术后复发患者长期缓解1例并文献复习

Long-Term Remission Achieved by Modified Donor Lymphocyte Infusion Combined with Chemotherapy and Azacitidine Maintenance Therapy in a Patient with Recurrence after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation: A Case Report and Literature Review

摘要: 供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion, DLI)通过诱导移植物抗白血病(GVL)作用，是目前治疗异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后复发患者有效的策略之一。本文报道了一例14岁CMML移植后血液学复发患者，接受了CAG方案(注射用盐酸阿柔比星、注射用盐酸阿糖胞苷、G-CSF)化疗后联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的改良供者淋巴细胞输注(mDLI)治疗，并在MRD转阴后给予阿扎胞苷(AZA)维持治疗获得了长期缓解。

Abstract: Donor lymphocyte infusion (DLI) is one of the effective strategies for the treatment of relapsed patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) by inducing graft-versus-leukemia (GVL). This article reported a 14-year-old patient with hematological relapse after CMML transplantation. He received CAG regimen (aclarubicin hydrochloride for injection, cytarabine hydrochloride for injection, G-CSF) chemotherapy combined with granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) mobilization modified donor lymphocyte infusion (mDLI) treatment, and maintenance treatment with azacitidine (AZA) after MRD negative conversion achieved long-term remission.

1. 引言

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)及其所产生的移植抗白血病(GVL)效应是治疗血液系统恶性疾病最重要、最基本的部分。尽管allo-HSCT取得了显著的成功，但复发似乎是当前移植后治疗失败和死亡的最重要原因，尤其是在高危患者中。复发后肯定有疗效的方法有限，供者淋巴细胞输注(DLI)通过诱导移植物抗白血病(GVL)作用，是目前治疗移植后复发有效的策略之一。但是会增加能够危及生命的GVHD的风险，目前有部分方法可以明显减少GVHD的发生率，对于其效果本文做了一些总结。

AZA的抗白血病作用和免疫调节特性与DLI相结合可以进一步增加对残余白血病细胞的免疫应答 [1] 。有相关研究对HSCT时高危患者使用了低剂量的AZA和DLI进行预防性治疗，发现可以有效降低移植术后复发的风险 [2] 。但是对于HSCT后复发的患者DLI是否需要加用AZA维持治疗缺乏相关研究。本例患者在HSCT后血液学复发后使用了CAG方案化疗联合mDLI，后给予AZA维持治疗获得了长期缓解。为HSCT复发后患者DLI治疗后是否应用去甲基化药物维持治疗提供了有效的证据。

2. 资料与方法

2.1. 患者移植前资料

患者14岁男性，2018年因“口角疼痛10天，水泡伴红斑3天”入院，血细胞分析：幼稚细胞0.07，白细胞计数8.35 × 10⁹/L，单核细胞百分比0.230，中性粒细胞计数3.42 × 10⁹/L，单核细胞计数1.92 × 10⁹/L，红细胞计数3.98 × 10¹²/L，血红蛋白106.0 g/L，血小板计数293 × 10⁹/L；骨髓细胞学(见图1)：骨髓增生明显活跃，粒:红 = 8.9:1；粒系增生明显活跃，成熟阶段比例减低，以上各阶段比例增高，其中原始粒细胞占5.5%，嗜碱性粒细胞比例亦增高；淋巴细胞减低，形态大致正常，单核细胞比例明显升高。骨髓流式可见4.06%异常髓系原始细胞及15.99%幼稚单核细胞。骨髓活检：骨髓增生极度活跃，呈填塞性。粒红系比例增大，粒系增生占绝对优势。粒系各阶段细胞均可见，幼稚阶段细胞增生，CD34部分阳性，CD117部分阳性，部分中晚幼粒系细胞散在分布。少量中晚幼红系细胞散在分布。部分巨核细胞散在分布，幼稚单圆核、小巨核易见。凋亡细胞及核分裂像易见。可见少量含铁血黄素沉着。纤维组织增生，网织纤维染色：阳性(2+)。组织学图像符合CMML，建议结合临床及其它实验室检查。白血病相关融合基因阴性；白血病相关22种突变基因NGS筛查：检测到SF3B1:NM_012433:exon15:c.A2098G:p.K700E基因位点突变；TET2 SNP。染色体：正常核型。腹部CT示肝大，脾大。FAB分型：发育异常型CMML (MD-CMML)；WHO分型：CMML-1；CPSS-mol评分1分，中危1；MMM评分4分，中危2。

2.2. 外周血干细胞动员、采集与输注

供者女，21岁，为患者姐姐，HLA10/10，接受G-CSF动员，经费森尤斯血细胞分离机行外周血造血干细胞采集，经32次循环，200分钟，总过血量10,000 mL，共采集外周血干细胞悬液220 mL。于2019.09输注干细胞共217 mL，按患者34 kg公斤体重计算，共输注MNC 19.8 × 10⁸/kg，CD34 7.9 × 10⁶/kg。

2.3. 预处理方案

采用改良的白消安/环磷酰胺(BU/CY)方案：FLU 30 mg/m² d-6到d-4，IDA 15 mg/m² d-6到d-4，BU 0.8 mg/kg∙q6h d-9到d-7，CY 40mg/kg d-3到d-2，ATG 2.5 mg/kg d-3,-2，同时给予抗排异、预防VOD、保肝、护胃、止吐、水化、碱化等对症处理。

2.4. 并发症的处理

预处理期间黏膜炎较重，合并胃粘膜出血，给予核黄素、奥曲肽等对症治疗。出现粒细胞缺乏伴发热，肺部细菌和真菌感染，先后给予比阿培南、万古霉素、替加环素、伏立康唑等抗感染治疗，同时细胞因子促进造血，输注血制品等对症保护，MMF、CSA、MTX等预防GVHD，更昔洛韦等抗病毒治疗，奥美拉唑护胃、天晴甘美保肝等治疗。

2.5. 移植后评估

+14 d白细胞植入，+16 d血小板植入，供受双方血型相合，+22天STR提示100%植入，无GVHD表现，+40 d复查骨髓细胞学：成熟单核细胞7%；MRD：单核细胞占有核细胞11.22%，幼稚单核细胞占有核细胞3.1%。评估为CR。

2.6. 复发资料

患者定期复查，于+95 d检查示移植后复发，血细胞分析：幼稚细胞0.01，白细胞计数1.26 × 10⁹/L，单核细胞百分比0.370，中性粒细胞计数0.21 × 10⁹/L，淋巴细胞计数0.55 × 10⁹/L，血红蛋白101.0 g/L，血小板计数64 × 10⁹/L，骨髓细胞学示单核细胞比例明显升高，占32.5%，其中幼稚单核占11.5%；MRD：单核细胞占有核细胞31.49%，幼稚单核细胞占有核细胞11.92%，STR 47.4%。

2.7. 复发后治疗

移植后+95 d提示复发后，于+100 d行CAG方案(注射用盐酸阿柔比星15 mg iv qd d1-4、注射用盐酸阿糖胞苷15 mg iH q12h d1-5、重组人粒细胞刺激因子注射液300 ug iH qd d1-5)治疗，化疗药物停止3个半衰期后，于+106 d给予mDLI (分三次递增式输注)治疗，未进行常规GVHD预防，+458 d给予阿扎胞苷(100 mg iH qd d1-5，周期28天)维持治疗，共治疗5个周期。

2.8. 供者淋巴细胞输注

供者接受G-CSF动员，经费森尤斯血细胞分离机行外周血细胞采集，经32次循环，200分钟。总过血量10,000 mL，采集外周血细胞悬液182 mL冻存，于+106 d，+113 d，+120 d分别输注MNC 1 × 10⁷/kg、3 × 10⁷/kg、1 × 10⁸/kg。

2.9. 结果

+123 d患者出现3级aGVHD，全身皮肤处散在皮疹，颜色稍红，瘙痒不明显，末诉疼痛，皮疹处无化脓及脱屑，复查STR 51.6%、MRD阴性，给予吗替麦考酚酯、环孢素、甲泼尼龙、芦可替尼等治疗后症状缓解，+161 d STR 100%、MRD阴性，评估病情为CR。后给予阿扎胞苷维持治疗，定期复查STR 100%、MRD持续阴性，目前仍在持续随访中，自确诊至完稿，患者已生存55个月。

3. 讨论

本例患者采用G-CSF动员采集DLI即修正的供者淋巴细胞(MDLI)，动员后的PBSCs富含更多的CD34+、CD14+、CD3+细胞以及Th1分化为Th2的细胞因子 [3] 。Corina等人进行了一项回顾性分析来评估G-CSF动员的DLI的作用，44例患者接受传统DLI或G-CSF-DLI来预防和治疗复发或建立异源HCT后的全供体嵌合。G-CSF-DLI患者队列显示，有向完全供体嵌合的转化且复发或疾病进展的发生率较低，而GVHD的发生率没有显著增加 [4] 。研究发现低剂量单个核细胞可能降低DLI后GVHD的发生率，增加总生存率而不影响总有效率。递增式DLI治疗后GVHD的发病率及危害程度要小于一次输注，即使接受剂量相同，递增剂量组的GVHD发病率仍低于一次输注 [5] 。

3.1. DLI的时机、剂量与并发症

移植后复发治疗方案有血液学复发后治疗、抢先治疗和复发的预防 [6] 。并且相比抢先性供者淋巴细胞输注，预防性供者淋巴细胞输注组具有更低的3年复发率(25.3% vs 36.7%, P = 0.02)和更高的无进展生存率(63.4% vs. 53.0%, P = 0.026) [7] 。移植后血液学复发患者一旦诊断明确，应停用免疫抑制剂并尽早开始治疗 [8] 。DLI的剂量与GVHD的风险相关，给药T细胞大于1 × 10⁸/kg风险可达50%，而给药T细胞小于1 × 10⁷/kg风险可低至10% [9] 。DLI可以增强GVL效应，但有并发能够危及生命的GVHD的风险，目前有部分方法可以明显的减少GVHD的发生率，遗憾的是还未做到与GVL效应的完全分离。据报道，急性和慢性移植物抗宿主病的发病率分别为32%和38%，预防性DLI比治疗性DLI与移植物抗宿主病的发生率低，分别为56%和80%。此外，Frey等发现急性和慢性移植物抗宿主病的发病率分别在40~60%和33~61%之间，死亡率为6~11%，尽管GVHD的风险相对较高，但死亡风险仍然较低 [10] 。短期免疫抑制剂包括CsA或MTX等，可以有效的预防以及控制GVHD的发生，需依供者类型和既往GVHD情况调整方案。同胞HLA相合者DLI后应用MTX共4周，每周1次，每次10 mg；单倍型移植患者，如复发前无重度GVHD，应用CsA 3周，之后无GVHD开始减量继之以MTX 3周，用法如上；如复发前曾有重度GVHD，应用CsA 6周，4周时无GVHD即开始减量，至6周停药；若为同胞HLA全相合移植，递增式DLI不一定常规作GVHD预防 [8] 。DLI后并发血细胞减少的发生率约为20~40%，死亡率为5%，主要因素为宿主残留造血细胞的比率与供者源造血功能的恢复，常见的死亡原因为感染和出血。

3.2. 其他的DLI方法

DLI的应用类型及方法有很多，主要针对如何减少细胞毒性对正常组织的损害、减少GVHD的发生、增强GVL效应进行了多种探索，除本例患者采用的G-CSF动员的DLI、递增式DLI输注外，还有CD8+T细胞去除的DLI、HSV-TK转导的T细胞治疗、照射后的DLI、去除α、βT细胞的DLI等方式，此外还有mLSTs、TCR-CD19等特异性细胞治疗(见表1)。

在一项前瞻性研究比较预防性CD8+T细胞去除的DLI与常规DLI的使用中，Soiffer等人发现在CD8+T细胞去除的DLI组中没有患者发生GVHD，而常规DLI组67%患者发展为GVHD，表明使用CD8+T细胞去除的DLI可以降低DLI后GVHD的风险 [11] 。在Weissinger的研究中，11例经HSV-TK转导的T细胞治疗的患者中，有2例出现了I级或II级aGVHD。1例患者发生急性GVHDII级，经更昔洛韦治疗成功，证实了HSV-TK基因转移通过更昔洛韦治疗控制急性GVHD的可行性，并且在大多数患者中转导的细胞持续存在约2年，表明转导的细胞能够移植和扩张 [12] 。Yong-Qiu的研究纳入了7例自体造血干细胞移植后接受7.5 GyX线照射的外周单核细胞输注的患者，大多数患者在DLI后获得不同程度的缓解，无出现GVHD的患者，并且7.5 Gy照射后淋巴细胞的增殖受到有效抑制，细胞毒性没有任何显著降低，表明其在降低GVHD发生的同时仍可保持良好的GVL效应 [13] 。与DLI相比，白血病特异性T细胞(leukemia-specificT cells, mLSTs)在体外可选择性识别并杀死表达白血病抗原的细胞，而对移植受体的正常细胞没有活性。在Lulla的研究中，mLSTs输注在AML/MDS复发的预防及治疗中显示出初步的良好疗效，尤其是在预防高危患者的复发方面，疗效非常显著，同时也未发生严重的GVHD。而对于已经复发的AML/MDS患者，输注mLSTs亦有不俗的疗效，2例患者出现缓解(其中1例CR，1例PR) [14] 。在一定程度上表明mLSTs输注对于预防和治疗高危AML/MDS患者移植后复发方面具有良好的疗效及安全性。

3.3. DLI联合化疗

本例患者通过化疗后联合DLI治疗，获得了良好的治疗效果，并且后期AZA维持治疗做到了长期缓解。化疗联合DLI己经成为HSCT后复发的有效治疗方法，特别是对血液学复发患者疗效更佳，DLI前化疗可进一步降低肿瘤负荷，可以减少复发，提高HSCT后MRD阳性患者的生存率 [15] 。常见的联合药物有DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂——阿扎胞苷(AZA)/地西他滨、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂——帕比司他/西达本胺等。对于Ph1 + ALL患者，有部分报道DLI联合酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物也有不错的效果，例如Tiribelli报道了一例移植后复发的耐伊马替尼Ph1 + ALL患者，给予了标准剂量的尼洛替尼和每月一次的DLI输注的联合治疗，耐受性良好并且达到了完全缓解 [16] ；Botta报道了一例32岁移植后复发的耐达沙替尼Ph1 + ALL患者，给予联合ponatinib和DLI作为二线治疗后获得了持续的MRD阴性 [17] 。Claiborne研究了28例移植后复发的AML或MDS患者，并接受AZA-DLI治疗，治疗后1年总生存期(OS)为44%；两年的OS为35%，并且在那些达到缓解的患者中，CD4+细胞计数有上升的趋势 [18] 。BHS报道了一项前瞻性研究，给予49例移植后复发患者序贯低剂量AZA和DLI治疗，有17例(34.7%)达到6次AZA疗程，4例患者接受了额外的AZA疗程。11例(22.4%)患者对AZA有反应，包括10例CR/CRi和1例PR [19] 。Kalin等人证实HSCT后患者在DLI治疗前，单独使用帕比司他或联合低剂量地西他滨进行治疗是可行的，且复发率相对较低 [20] 。

3.4. 总结

DLI是移植后复发的主要治疗方法，增强GVL效应并降低GVHD的发生，是目前探究的主要目的。本例患者通过化疗联合mDLI后MRD转阴，后给予AZA维持治疗后获得了长期缓解。完善化疗方案并且联合mDLI有望成为恶性血液病移植后复发的主要治疗手段，目前指南尚未明确DLI联合去甲基化药物维持治疗的策略，对于其效果值得进一步探索。

Figure 1. Bone marrow smear (sp × 100), (sp × 1000)

图1. 骨髓涂片(sp × 100)、(sp × 1000)

Table 1. Summary of DLI after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

表1. 异基因造血干细胞移植术后DLI总结

注：缩写：DLI = 供者淋巴细胞输注；GVHD = 移植物抗宿主病；NA = 不可用；AML = 急性髓系白血病；ALL = 急性淋巴细胞白血病；MDS = 骨髓增生异常综合征；CML = 慢性粒细胞白血病；MM = 多发性骨髓瘤；MPD = 骨髓增殖型疾病；MF：骨髓纤维化；NHL = 非霍奇金淋巴瘤；G-CSF = 粒细胞集落刺激因子；MMRD = 不匹配亲缘供者；MRD = 匹配亲缘供者；MMUD = 不匹配无关供者；MUD = 匹配无关供者。

NOTES

^*通讯作者。