摘要: 本研究从球等鞭金藻培养液中分离出一种藻际细菌
Microbacterium_paraoxydans(副氧化微杆菌)，其对2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)胁迫具有一定的耐受性。之后利用基因组学技术分析了副氧化微杆菌的潜在功能。结果表明：(1) 在50 mg/L BHT条件下副氧化微杆菌仍保持生长。(2) 利用基因组学技术，得到35个基因组序列GC且含量为70.38%。(3) COG注释中记录了2908个基因。其中335个碳水化合物的运输和代谢基因。KEGG注释中将副氧化微杆菌的基因功能分成6大类。其中最多的是碳水化合物代谢，注释了214个基因；生物降解和代谢注释了63个基因，包含12个通路，11个均与有机物降解有关。另外，环境信息处理通路中信号转导通路有10个，基因有76个。细胞过程中有关细菌趋化性的基因有7个。(4) KEGG注释了28种与酚类物质相关的生物降解和代谢基因，表明
Microbacterium_paraoxydans具有降解和耐受有机污染物的能力，在基因角度解释了其在有机污染物BHT存在下可以生长的原因。(5) 代谢系统中预测到类胡萝卜素基因簇中包含合成类胡萝卜素的首要步骤所需要的
crtB基因、
idrA_B_C_D。
Abstract:
This study isolated a microalgal bacterium, Microbacterium_paraoxydans, from the culture medium of Pseudomonas aeruginosa, which has a certain tolerance to 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (BHT) stress. Subsequently, genomic techniques were used to analyze the potential functions of Microbacterium_paraoxydans. The results showed that: (1) Under the condition of 50 mg/L BHT, the growth of Microbacterium_paraoxydans was still maintained. (2) Using genomic technology, 35 genomic sequences were obtained with a GC content of 70.38%. (3) 2908 genes were recorded in the COG annotation. Among them, there are 335 genes involved in carbohydrate transport and metabolism. The KEGG annotation categorizes the gene functions of Microbacterium_paraoxydans into six major categories. The most common one is carbohydrate metabolism, with 214 genes annotated; biodegradation and metabolism annotated 63 genes, including 12 pathways, all 11 of which are related to organic matter degradation. In addition, there are 10 signal transduction pathways and 76 genes in the environmental information processing pathway. There are 7 genes related to bacterial chemotaxis in cellular processes. (4) KEGG annotated 28 biodegradation and metabolism genes related to phenolic substances, indicating that Microbacterium_paraoxydans have the ability to degrade and tolerate organic pollutants. From a genetic perspective, it explains why they can grow in the presence of organic pollutant BHT. (5) It is predicted in the metabolic system that the carotenoid gene cluster contains the crtB gene and idrA_B_C_D required for the primary step of carotenoid synthesis.
1. 引言
微藻可以通过细胞活动将光和二氧化碳转化生成特殊化学物质，包括碳水化合物、维生素、脂类、蛋白质、色素等 [1] 。现代工业生产的快速发展，许多工业废水、生活污水进入水体流域，破坏了海洋生态系统的稳定自身特性(易富集)，有必要研究BHT对自然环境生物的影响。BHT作为合成酚类抗氧化剂，成本低且具有较强的抗氧化性，在全球范围内被广泛添加到产品中作抗氧化剂。2000年，全球BHT产量高达六万多吨 [2] ，被欧盟列为“高产量化学品” [3] 。BHT在自然环境中会产生一系列物理化学反应，其本身以及反应生成的代谢有机物在环境中已被作为新型有机污染物多次检测到。在哥伦比亚种植水稻的地表水中检测到BHT及其代谢产物是主要有机污染物 [4] 。在中国太湖检测到BHT及其代谢产物BHT-Q是沉积物中主要有机污染物 [5] 。西班牙塔拉戈纳工业园区的室外空气中检测到BHT和BHT-Q [6] 。韩国海洋塑料中也同样检测到BHT (29 µg/g) [7] 。污染物胁迫使微藻生物量降低并损伤叶绿体，因此生物量和色素含量常被作为污染物对藻类影响和水体污染程度的内在评价指标。目前世界上大规模培养且商业化应用的微藻主要分为金藻门、红藻门、绿藻门和蓝藻门 [8] 。球等鞭金藻属于金藻门，体积微小、没有细胞壁、繁殖速度快、富含多糖以及各种多不饱和脂肪酸 [9] ，在水产养殖方面常被用作海洋动物的饵料 [10] ，是合成类胡萝卜素等抗氧化活性物质的潜在生物 [11] 。球等鞭金藻易于培养，因此在水环境生态系统中也常用作水生生态毒理学研究的理想生物 [12] 。
海洋中藻类和细菌已经共存了2亿多年，关系密不可分，它们之间的长久共存有利于藻菌之间的协同进化 [13] 。微藻生长环境周围存在着一片藻菌相互作用的微小区域——藻际环境 [14] 。这些藻类在其正常生长发育和繁殖的过程中，会分泌释放出不同的代谢产物例如氨基酸类物质，脂质，维生素，酶类物质等 [15] 。这些由微藻细胞分泌的代谢物质直接影响着这些微藻周围的环境，细菌会受到这些藻细胞在其生长的过程中释放的代谢产物的影响以及诱导，存留在藻细胞周围，从而形成了藻菌共栖群落 [16] 。生态环境中的微藻和细菌各自担任生产者和分解者的角色，它们之间的相互作用关系非常复杂，包括协同作用和信号转导等关系。最初发现微藻与细菌共生关系是在菌藻之间发生的O2/CO2交换，微藻利用光合作用生成O2供周围细菌呼吸并释放CO2，然后CO2被微藻利用于光合活动 [17] 。之后的研究中又深入探索了菌藻之间其他错综复杂的共生关系，发现两者之间还存在一种信号分子转导机制。Amin [18] 利用转录组学技术，发现藻际细菌的色氨酸合成基因下调，并通过代谢物分析证明了细菌产生了吲哚乙酸(IAA)，刺激硅藻分裂。
全基因组测序技术(Whole Genome Sequencing)是对生物体中完整的遗传物质的总和进行测序的一项分子生物学技术，可获得生物体完整的生物信息学信息 [19] 。细菌基因组分析主要分为6部分，包括DNA提取及测序、基因组组装、基因组完成、基因预测、基因注释和比较基因组分析，被认为是一种强大的基因组分析技术，能够全面、精确地获得基因组中全部序列，从而通过基因组组分分析、基因功能注释等充分完整地认识微生物的生物学功能，破解生物体中所包含的耐药性、致病性等信息 [20] 。如今，基因组测序技术已经发展到第三代。技术的更新迭代，使人类对基因组分析更加广泛深入，主要集中应用在溯源、功能基因鉴定等方面 [21] 。
2. 材料与方法
2.1. 藻种及菌株
球等鞭金藻(I. galbana)：取自中国科学院海洋研究所，采用f/2培养基培养；
藻际细菌：采用稀释涂布平板法从球等鞭金藻藻液中筛出菌株，并用平板划线法进行纯化，之后利用甘油保菌法进行保种。
2.2. 实验方法
2.2.1. 藻种培养
在无菌环境下将球等鞭金藻接种到f/2液体培养基中，设置三组平行并置于光照培养箱(设置温度：25 ± 1℃，光照强度：3800 Lux，光暗周期：12/12 h)扩大培养。每天定时摇晃锥形瓶，避免微藻沉积造成营养液应用不充分。
2.2.2. 细菌培养
采用稀释涂布法，将藻液用无菌水稀释(稀释梯度为1:100、1:1000、1:10000)，每个梯度各取微量藻液于2216E固体培养基，并用接种环将藻液均匀分散在培养基表面，整个操作过程应在无菌操作台且在火焰附近进行，最后置于生化培养箱(设置温度：29.1℃)扩大培养3~4 d。然后采用平板划线法挑取单一菌株于固体培养基进行菌种纯化。纯化后的菌株用甘油保种法在−80℃下进行保种。
2.2.3. BHT母液配制
称取BHT于干净烧杯中，用DMSO进行助溶，配制浓度为50 mg/L的BHT母液。BHT作为抗氧剂暴露在空气中极易被氧化，为避免实验误差，实验中需要现用现配。根据预试验设置后续实验中BHT的浓度梯度为0、10、20、40 mg/L，本实验所用的BHT溶液均用50 mg/L的BHT母液稀释后使用。
2.2.4. 生长量测定
藻际细菌生物量测定：在无菌操作台分别取5 mL混匀的菌液，用可见分光光度计测定藻液在600 nm处的吸光度来反映藻际细菌的生长状况。
2.2.5. 样品制备、文库构建
取适量菌液离心(4000 rpm, 20 min)弃上清保留菌泥并做好标记。收集DNA进行片段化处理，构架吧基因组测序文库。通过琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选后，利用氢氧化钠变性，生成DNA单链片段。
2.2.6. PCR扩增
使用扩增引物正向338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和反向806R (GGACTCHVGGGTWTCTAAT)对提取的DNA基因片段进行扩增预试验。正式PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反应体系，如表1，PCR反应条件如表2。PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl缓冲液洗脱。再将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量。最后用Illumina进行文库构建测序。
2.2.7. 测序数据制备
利用Illumina测序后得到原始数据保存为fastq格式，为了精确组装，原始数据中一些低质量数据会被剪切，经过质控过滤，并对初步组装的基因组数据进行质量评估，原因包括：(1) 判断序列是否被杂菌污染；(2) 评估测序质量；(3) 评估基因组情况。校正后得到高质量的有效代表序列。
3. 结果
3.1. BHT存在条件下藻际细菌的生长状况
Figure 1. Growth of algal bacteria under 50 mg/L BHT conditions
图1. 藻际细菌在50 mg/L BHT条件下的生长量
通过稀释涂布法、平板划线法从球等鞭金藻藻际环境中筛选出16种细菌。在无菌海水中加入适量菌液并设置BHT浓度为50 mg/L以保持细菌的生存环境中只有BHT，置于摇床培养5天。用可见分光光度计测量菌液在600 nm处的吸光度以表示藻际细菌的生长状况(如图1所示)。其中15种细菌在5天内生长量始终保持下降趋势；只有副氧化微杆菌(Microbacterium_paraoxydans)在只有50 mg/L BHT条件下生长量先呈现出下降趋势，2天后，生物量开始逐渐上升。第5天时Microbacterium_paraoxydans与初始量相比增加了106.67%。
有研究报道，副氧化微杆菌一般可以从石油污染的湖泊和含重金属的植物、土壤中分离出来 [22] ，可以有效除去氯苯和镉，对降解有机污染物、净化水体等方面有重要作用 [23] ，利于生物修复。所以在有机污染物BHT的条件下，副氧化微杆菌可以利用BHT以保证自身生长。因此本研究利用基因组学技术分析副氧化微杆菌的潜在功能，为菌藻共生系统的相关研究提供依据。
3.2. 副氧化微杆菌的功能预测
3.2.1. 样本信息
利用Illumina测序平台，对菌株基因进行质控分析，获得总碱基1503117362bp，进一步组装得到35个基因组序列，其中染色体序列有13个，已知质粒基因组序列有10个，新的质粒基因组序列有12个(如表3和表4)。微生物的DNA中GC含量一般不会受外界环境干扰而轻易发生更改，所以，GC含量经常被用来比较微生物种属间的亲缘关系，判断物种同源性。菌株的GC含量为70.38%，因此可以判定其与数据库中的物种是同源。
Table 4. Genomic sequence information
表4. 基因组序列信息
3.2.2. 基因组功能注释
Figure 2. Genomic COG annotation of Microbacterium paraoxydans
图2. 基因组COG注释图
Figure 3. Genomic KEGG annotation of Microbacterium paraoxydans
图3. 基因组KEGG注释图
通过与数据库比对进行功能注释，得到的功能注释信息如图2和图3。COG注释图中可以看出，共记录了2908个基因。其中361个转录基因(K)，335个碳水化合物的运输和代谢基因(G)，314个氨基酸运输与代谢基因(E)。
KEGG注释结果将副氧化微杆菌的基因功能分成6大类。新陈代谢通路被注释的基因最多，有2883个；其中最多的是碳水化合物代谢，注释了214个基因，15个通路；生物降解和代谢注释了63个基因，包含12个通路，11个均与有机物降解有关。综上，在只有BHT存在的条件下，副氧化微杆菌通过对有机物的代谢或降解以维持自身生存。另外，环境信息处理通路中信号转导通路有10个，基因有76个。细胞过程中有关细菌趋化性的基因有7个。
3.2.3. 生物降解及代谢分析
表5展示了Microbacterium paraoxydans的基因组中有关生物降解和代谢功能的基因。通过KEGG功能注释，该菌株Microbacterium paraoxydans共注释了28种有机物降解基因，表明其具有降解和耐受有机污染物的能力，在基因角度解释了Microbacterium paraoxydans在有机污染物BHT存在下可以生长的原因。
Table 5. Biodegradation and metabolic gene statistics of Microbacterium paraoxydans
表5. Microbacterium paraoxydans的生物降解及代谢基因统计
3.2.4. 次级代谢产物合成分析
微生物生长到稳定期，会利用初级产物进行代谢合成一些有重要生态功能的次级代谢产物。副氧化微杆菌预测出5种基因簇。其中类胡萝卜素基因簇中所包含的基因数量有19个，包括crtB等。
Figure 4. Linetype map of carotenoid gene clusters
图4. 类胡萝卜素基因簇线型图谱
类胡萝卜素在细胞间通信、抗菌抗癌中起到重要作用。它可以作为抗氧化剂保护微生物免受活性氧累积引起的氧化应激损伤。因此细菌合成类胡萝卜素具有特殊意义，目前有关参与合成类胡萝卜素的细菌基因已经被鉴定。Swati Ojha等 [24] 利用LB培养基培养了一种副氧化微杆菌提取并鉴定出类胡萝卜素。P. Krubasik等 [25] 人从亚麻短杆菌中鉴定出类胡萝卜素(crt)的基因簇，如图4。八氢番茄红素合成酶基因crtB催化两个香叶基香叶酰二磷酸分子合成八氢番茄红素是类胡萝卜素生物合成的第一个步骤。在本研究中注释到crtB和idrA_B_C_D，说明副氧化微杆菌具有潜在的类胡萝卜素生物合成能力。
4. 结论
副氧化微杆菌可以有效降解有机污染物，因此在只有BHT条件下可以生存，在第5天生长量增加了106.67%。二代测序得到菌株的GC含量为70.38%，因此可以判定其与副氧化微杆菌是同源。COG注释中记录了2908个基因。其中361个转录基因，335个碳水化合物的运输和代谢基因，314个氨基酸运输与代谢基因。KEGG通路将基因功能分成6大类。新陈代谢通路被注释的基因最多，有2883个；其中最多的是碳水化合物代谢，注释了214个基因，15个通路；生物降解和代谢注释了63个基因，包含12个通路，11个均与有机物降解有关。另外，环境信息处理通路中信号转导通路有10个，基因有76个。KEGG注释了28种生物降解和代谢基因，表明Microbacterium paraoxydans具有降解和耐受有机污染物的能力，在基因角度解释了其在有机污染物BHT存在下可以生长的原因。细胞过程中有关细菌趋化性的基因有7个。副氧化微杆菌中含有合成类胡萝卜素首需的crtB基因，因此可以解释其在BHT条件下可以对BHT产生的活性氧进行去除以保持生长。
NOTES
*通讯作者。