1. 引言
近年来，微生物污染引起的食品安全问题日益受到社会关注。微生物对食品和医疗设备都具有巨大的破坏力。它们的存在不仅会加速食品变质和腐烂，还会带来污染医疗器械和药物的风险 [1] 。在随后的几十年里研究者发现了合成防腐剂由于其长期不利的毒理学影响而在一些国家禁止使用。所以人们将目光转而投入到健康安全的天然植物精油上去，然而，在不断探索天然植物精油在医药和食品领域的应用时，也发现了一些潜在的问题。这些精油的快速释放率和大量释放可能会危及药品安全和食品质量。因此，控制精油释放的挑战亟需关注和解决。
缓释技术是将活性物质与缓释基质结合在一起，使活性物质以可控的速度逐渐释放到外部环境中。这种释放机制是通过以下几点实现的，包括缓释基质的破裂、扩散、降解和溶解以及基质间的压力差驱动的渗透等。在持续时间内，活性物质在系统中保持特定的有效浓度 [2] 。此技术能将生物活性物质从液态转化为固态，便于在特定条件下长期控制释放，加强了活性化合物的功效和稳定性。
气凝胶在其纳米孔洞中充满了气体分散介质，因其特殊的网络结构而具备了一系列特殊的性能，如密度低、高孔隙率、低导热率以及低声阻抗等，所以气凝胶受到可食包装、医疗卫生、绝热隔热、航天航空等专家学者的密切关注。其中在可食包装和医疗等领域可被用以制作生物活性物质的载体、生物支架和伤口敷料等 [3] ，是一种极具应用前景的新型材料。
薄荷醇是从薄荷中提取的天然手性萜烯化合物，有八种立体异构体 [4] 。其中，L-薄荷醇(Menthol, Mel)为无色针状固体，相对分子量为156.4，沸点为216.4℃，熔点为44℃，具有刺激性的气味和一定的清凉作用。然而，它的高挥发性和低耐热性等缺点限制了它在食品和制药领域的应用。目前，已有研究通过制备微胶囊来控释Mel。Hu [5] 等以β-环糊精金属有机框架为基体，包封了Mel。并在模拟唾液条件发现Mel的释放速度得到了控制，并且Mel的包封率达到了30.6%。
高粱醇溶蛋白(Kafirin, Kaf)是一种含量十分丰富的蛋白质，约占高粱蛋白质总量的75%~85% [6] 。Kafirin和Zein在结构上有许多相似的地方，这使得Kaf的许多特征(溶解度、摩尔质量、氨基酸组成等)和Zein相似 [7] 。但是，Kaf的疏水性能比Zein更加优秀，同时根据Tilman J. Schober等的研究 [8] ，蛋白质分子之间的疏水相互作用对膜的形成有重要影响。基于Kaf的疏水特性，其被用以包封生物活性物质方面有良好的表现。Li [9] 等人先以Kaf为基体制备了Kaf-姜黄素纳米颗粒，再通过静电逐层沉积法制备了碳酸钠/Kaf-姜黄素纳米颗粒，结果表明，复合纳米颗粒对姜黄素的包封率较高。此外也有研究发现使用Kaf制备的纳米颗粒在胃肠道环境下可以增强对生物活性物质的保护作用 [10] 。
壳聚糖(CS)是由甲壳类动物的壳中提取出的甲壳素经脱乙酰化得到的β-(1,4)-2-乙酰氨基-D-葡萄糖单元和β-(1,4)-2-氨基-D-葡萄糖单元构成的共聚物 [11] 。它是已知天然高分子多糖中唯一的阳离子多糖，具有乙酰氨基、氨基和羟基等多种官能团。由于CS具有独特的阳离子性质，其结构单元与糖胺聚糖相似可以在不同条件下构建活性物质缓释体系，并且具有使活性物质活性增强的特点 [12] 。此外，CS在酸性溶液中的阳离子特性有助于通过与海藻酸钠、明胶、硫酸盐、酪蛋白磷酸肽和柠檬酸盐等其他制剂的离子交联形成稳定的缓释体系 [13] ，这种多功能性使CS广泛应用于缓释体系的构建。Zhao [14] 等将乳清分离蛋白(WP)和羧甲基壳聚糖(CMCS)采用溶胶–凝胶法和冷冻干燥制备出了食品级气凝胶，并负载虾青素。结果表明，随着CMCS浓度的增大，复合气凝胶表现出优异的氧化稳定性，此外虾青素的缓释效率也有明显提高，证明了利用蛋白质/多糖构建缓释气凝胶是可行的。
为解决Mel释放速率快、耐久性差等难题，本文以CS、Kaf为基体制备复合气凝胶来负载和缓释Mel。再通过真空冷冻干燥来得到复合气凝胶。通过扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)对复合气凝胶进行分析表征，然后采用万能材料试验机、耐水性能测试、气相色谱–质谱联用仪对复合气凝胶力学性能、耐水性能、负载性能以及缓释进行测试，对比研究了GTA、Kaf对复合气凝胶力学、负载、缓释等性能的增强机理。
2. 实验部分
2.1. 实验主要原料
Mel购自国药化学试剂有限公司，规格为分析纯；CS购自浙江金壳药业股份有限公司，规格为分析纯；高粱粉购自兰州市场。
2.2. 实验主要设备
数显恒温水浴锅(HH-1)，购自金坛区白塔新宝仪器厂；电动搅拌器(HD2010W)，购自上海司乐仪器有限公司；超声波清洗机(KS-50E-2)，购自海曙科生超声设备公司；真空冷冻干燥机(Scientz-30YG/A)，购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
2.3. 样品制备
首先称一定量脱脂脱色的高粱粉，以固液比为1:5加入到含0.5%偏重亚硫酸氢钠的75%乙醇溶液里，随后在500 W微波功率下总共进行5次微波处理，30 s/次(每次微波后需冷却至室温)共150 s，随后超声处理(40 min, 60˚C)后进行离心(4000 r/min)取上清液并加入过量的冷却蒸馏水，利用Kaf在不同溶液中溶解度不同将蛋白从上清液中全部析出，随后进行过滤并冷冻干燥得到Kaf。
复合气凝胶的制备工艺流程如图1所示。称取5 g Kaf粉末，加入含有85%无水乙醇的水溶液500 ml，持续搅拌1 h，直至Kaf溶解。随后用低速离心机(3000 r/min)进行离心，去除少量不溶性杂质。最终得到浓度为1%的Kaf溶液。再称取0.1 g Mel加入配制好的Kaf溶液中，进行20 min超声使其完全溶解后备用。然后再称取30 g CS粉末和1 g TA粉末，分别置于1000 ml和100 ml蒸馏水中，并搅拌至CS、TA完全溶解后得到CS质量分数为3%、TA质量分数为1%的溶液。接着将配制好的45 mlKaf溶液通过恒压滴液漏斗以3滴/s的速度加入到60 ml CS溶液中(CS:Kaf 4:1 6:1 9:1 12:1 w/w)，随后将9 ml TA溶液加入混合液中搅拌40 min，搅拌完成后将混合溶液置于模具中进行24 h预冷(−40˚C)，最后置于真空冷冻干燥机(−60˚C, 1 Pa)中48 h，得到负载有Mel的气凝胶样品，记作4C1K-M1；类似的方法，还制备了空白样CS-M1，6C1K-M1，9C1K-M1和12C1K-M1等组复合气凝胶。制备流程图如图1所示。
Figure 1. Flow chart of composite aerogel preparation
图1. 复合气凝胶制备流程图
2.4. 样品表征
采用SEM (Gemini500)在5 KV的加速电压下观测复合气凝胶的微观结构，测试前对样品进行5 min喷金处理。
采用FTIR对复合气凝胶各组分与CS之间的相互作用，测试范围 4000 cm−1~650 cm−1。
采用AG-IS万能材料实验机对复合气凝胶的抗拉强度和压缩模量进行测试。在测试之前需要将复合气凝胶切割为10 × 10 mm的圆柱体。实验机压缩速率为1 mm/min，压缩7 mm。每组实验重复4次取平均值。通过公式(1)来计算样品的压缩模量。其中ΔN为载荷的变化量，ΔL为位移的变化量，L为样品高度，A为样品横截面积。
(1)
通过乙醇置换法来测量复合气凝胶的孔隙度与密度。在测试之前，首先称量样品的原始质量M0，然后将其放入密封的量筒中加入无水乙醇直至没过样品。放置24 h后取出样品称重，并记为M1。依据式(3)计算复合气凝胶的孔隙率。每组实验重复三次并取平均值。
(2)
其中V0表示支架的体积。ρ表示无水乙醇的密度，取0.789 g/cm3。
根据上述实验，复合气凝胶的密度通过式(3)得到。
(3)
耐水性能：实验前，将复合气凝胶放入烘箱完全烘干并称重W0，再将复合气凝胶放入装有磷酸盐(PBS)缓冲液的烧杯中，封闭后平衡24 h后称重记为W1，接着再用滤纸将样品表明多余水分吸干后放入烘箱(70℃)直到重量不再变化，称重记为W2。由式(4)和(5)计算其吸水率和溶失率。
(4)
(5)
复合气凝胶的负载与缓释表征：首先配制Mel标准溶液，准确称取0.01 g Mel样品于100 ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度线得到浓度为100 ppm的Mel标准溶液，随后用移液枪分别移取配制好的标准溶液1 ml、2 ml、5 ml和8 ml于10 ml的容量瓶中，并用正己烷定容至刻度线，即可得到10 ppm、20 ppm、50 ppm和80 ppm的Mel标准溶液。
气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测试条件为：色谱柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，进样口温度250℃，分流比为20:1；色谱柱初始温度为60℃，保持3 min，先以5℃/min的速率升温至200℃，保持5 min，再以10℃/min的速率升温至250℃，保持3 min。
通过GC-MS对复合气凝胶中的Mel进行定量分析以进行包封率和负载率的计算。首先将真空冷冻干燥后的样品进行称重记为M0，随后将样品置于恒温恒湿(23˚C 50%)的养护箱中，每隔2 d取样并将样品置于离心管中，加入10 ml正己烷超声1 h，并在5℃的条件下放置24 h，随后进行离心(4000 r/min) 10 min，取上清液并用0.45 μm滤膜进行过滤测试。由式(6)、(7)和(8)分别计算包封率、负载率和释放率。
(6)
(7)
(8)
其中N0为定量分析所得样品中实际含有Mel含量(mg/ml)，N为实际添加的Mel含量，Nt为一定时间后样品中Mel含量。
3. 结果与讨论
3.1. 复合气凝胶的结构表征
对CS-M1和6C1K-M1 Mel释放前后这三种气凝胶样品的微观结构和形态进行表征。由图2(a)~(c)知，未加入Kaf的纯CS气凝胶表面呈现均匀光滑的表面形貌，在加入Kaf之后，气凝胶表面发生明显变化图2(d)~(f)：Kaf呈现球形并呈半包覆状态。这是由于Kaf与CS之间发生静电、疏水和氢键相互作用形成网络结构。如图2(g)~(i)所示，经过释放后的气凝胶相比于未释放时形貌明显发生改变，原本规整呈闭合状态的蛋白小球呈现出塌陷或开口状态，同时气凝胶表面产生微孔结构，说明CS/Kaf复合气凝胶成功包封了Mel并进行释放。
Figure 2. SEM images of composite aerogel specimens (a)~(c): CS-M1; (d)~(f): 6C1K-M1 before menthol release; (g)~(i): 6C1K-M1 after menthol release)
图2. 复合气凝胶试样的SEM图(a)~(c)：CS-M1；(d)~(f)：6C1K-M1薄荷醇释放前；(g)~(i)：6C1K-M1薄荷醇释放后
3.2. 复合气凝胶的FTIR分析
图3为6C1K、6C1K-G1、6C1K-G2、6C1K-G4以及Mel的红外光谱图。6C1K在3424 cm−1处的特征峰归因于-OH的伸缩振动，在1638 cm−1处的特征峰属于酰胺I带，在加入不同含量的GTA后，-OH峰分别移动到3428 cm−1 (6C1K-G1)、3433 cm−1 (6C1K-G2)和3434 cm−1 (6C1K-G4)处，1638 cm−1处的峰分别移动到1641 cm−1 (6C1K-G1)、1643 cm−1 (6C1K-G2)和1645 cm−1 (6C1K-G4)，这表明了GTA的醛基同时与赖氨酸残基或羟赖氨酸残基氨基发生席夫碱反应，生成了C=N双键，1559 cm−1处的特征峰属于游离的氨基，此峰的增加也说明了醛基与CS、Kaf中游离氨基发生反应形成共价亚胺键。
Mel在3259 cm−1处出现-OH特征峰，在3000 cm−1~2800 cm−1的峰属于-CH伸缩振动峰；在1038 cm−1处出现的峰属于C-O伸缩振动峰；在1380 cm−1处出现的峰属于异丙基振动峰 [15] 。与其他样品红外谱图相比，添加了Mel的6C1K、6C1K-G1、6C1K-G2、6C1K-G4除了1380 cm−1处的异丙基峰其他Mel特征峰均未出现，这说明Mel的羟基被包埋于Kaf的疏水腔内。异丙基的移动则说明了CS/Kaf与Mel可能发生了氢键反应 [16] 。由此可见，CS/Kaf复合气凝胶对Mel的包封是由于Kaf具有疏水基团和亲水基团，在反应过程中Mel由于疏水作用被包封于Kaf小球内，再与CS发生交联反应，从而形成了一个壳核结构。
3.3. 复合气凝胶力学性能
图4(a)，图4(b)给出了5种复合气凝胶样品的压缩应力应变曲线和压缩模量。如图可知，实验中这5
Figure 3. FTIR of composite aerogels
图3. 复合气凝胶的红外光谱图
Figure 4. Mechanical properties of different composite aerogels (a, c) compressive stress-strain curves (b, d) compressive modulus
图4. 不同复合气凝胶的力学性能(a、c)压缩应力应变曲线(b、d)压缩模量
种复合气凝胶的应力应变曲线都呈现出典型的弹性形变的特征，其特性主要有三种状态：线性弹性状态、塌陷状态和致密化状态，这些状态通过气凝胶的弯曲、孔隙的屈曲塌陷以及整个气凝胶孔隙完全塌陷来实现 [17] 。在初始阶段时，CS-M1样品的应力变化随着压缩的进行上升较为缓慢，在压缩应变达到20%时样品的应力仅有43.99 Kpa。而随着Kaf的加入，其余样品12K1C-M1、9K1C-M1、6K1C-M1和4K1C-M1样品应力提升趋势明显比纯CS样品快且压缩模量也有大幅度提升，这主要归结于Kaf的加入，使CS与Kaf之间发生氢键、静电等相互作用。同时可以注意到随着Kaf含量的增多，复合气凝胶的压缩模量也在不断地增加，从CS-M1的0.101 MPa增加至4C1K-M1的0.172 MPa，这表明Kaf含量的增加可以使复合气凝胶在内部形成更多的微孔结构，从而得以承受更强的压缩载荷拓宽其应用范围。图4(c)、图4(d)是添加了不同GTA含量的复合气凝胶压缩应力应变曲线与压缩模量。可知，随着GTA含量的增加，样品的力学性能明显提升，这归因于GTA与CS和Kaf之间的交联反应，增强了气凝胶基体的骨架强度。
3.4. 复合气凝胶的孔隙率和密度
表1显示了9种不同复合气凝胶的孔隙率和密度。可以看出随着Kaf含量的增多，复合气凝胶孔隙率在不断地下降而密度逐渐升高，这是因为Kaf在CS表明呈现包覆状态，结合密实。同时随着GTA含量的不断增多复合气凝胶孔隙率由88.52%减少到80.12%，这可能是加入GTA，溶液在冷冻时单位体积内溶剂分子所占空间缩小，聚集形成的晶核数目变小，所以样品真空干燥后形成的微孔数量有所下降，从而导致孔隙率降低。与此同时，GTA可与基体其余组分发生交联反应，导致复合气凝胶结构更致密，复合气凝胶孔隙率变低。总体而言，复合气凝胶的孔隙率总体仍保持在80%以上，满足缓释生物活性物质的要求。
Table 1. Porosity and density of composite aerogels
表1. 不同复合气凝胶的孔隙率和密度
3.5. 复合气凝胶耐水性能
图5(a)，图5(b)是不同Kaf含量复合气凝胶的吸水率与溶失率。从图5(a)可以观察到随着Kaf含量的不断增多，复合气凝胶的吸水率从2306.15%降低到1776.5%，溶失率从33.85%减小到22.83%，这说明加入疏水Kaf后，复合气凝胶的耐水性能得到了大幅度提升，这归因于CS与Kaf之间发生相互作用，形成了致密的气凝胶骨架，影响了水分子的迁移。如图5(b)所示，6C1K-G4的吸水率和溶失率为1490.5%和4.2%，这表明随GTA含量的增加，复合气凝胶的吸水率和溶失率进一步下降，这归因于GTA与基体之间发生席夫碱反应，进一步增强了气凝胶结构强度。
Figure 5. Water-resistance properties of composite aerogels
图5. 复合气凝胶的耐水性能
3.6. 薄荷醇的包封率和负载率
为了找到具有更高负载率与包封率的复合气凝胶，对CS-M1、12C1K-M1、9C1K-M1、6C1K-M1和4C1K-M1进行测试，其结果如图6所示。将CS-M1作为对照组，其包封率仅为21.26%，负载率为1.58%。随着Kaf含量的不断增加，可以得到包封率和负载率都是先升高后降低的趋势，6C1K-M1包封率和负载率最高为48.87%和3.1%，这是由于在Kaf-Mel溶液中，随着Kaf浓度的不断增大其对Mel的包封能力逐渐增强，到CS/Kaf为6:1时溶液中Mel接近饱和，这与钟璐的研究结果相似 [18] 。因此，选用CS/Kaf为6:1的比例进行后续实验。
Figure 6. Encapsulation and loading rates of menthol
图6. 薄荷醇的包封率和负载率
3.7. 复合气凝胶的缓释性能分析
图7是CS-M1和6C1K-M1复合气凝胶在恒温养护箱中的缓释曲线。Mel的包封有两种可能的机制，包括包合络合与物理吸附或截留 [19] 。图中CS-M1样品在前48 h内释放较快释放量分别为49.77%，Mel大约释放了一半，可能是由于Mel通过物理吸附或截留在CS-M1样品表面发生突释。在随后的时间里，由于气凝胶特殊的微孔结构，样品中的Mel缓慢地释放。而加入了Kaf的样品6C1K-M1在48 h释放了41.51%，在12 d之后释放量达到61%，低于CS-M1的78.12%，6C1K-M1样品明显的显示出对Mel的缓慢释放作用，这是由两方面因素决定的：首先是Kaf将Mel包封于疏水空腔内部，减缓了Mel从复合气凝胶内部的释放。其次是由于CS作为基体将Kaf蛋白小球很好的包覆起来，对Mel进行了二次保护，进一步延缓了Mel的释放。
Figure 7. Cumulative release of different composite aerogels
图7. 不同复合气凝胶的累计释放量
4. 结论
本文将天然植物精油Mel通过反溶剂法添加到Kaf溶液中，并采用凝胶–溶胶法制备了CS/Kaf/Mel复合气凝胶，并加入GTA进行交联。研究了不同CS/Kaf和GTA含量对复合气凝胶微观形貌、力学性能、耐水性能以及对Mel的负载和释放性能的影响，如下：
(1) 通过SEM观察到，Kaf在气凝胶中呈现球状并被包覆于CS基体之中。在经过释放后的气凝胶表面的Kaf小球形貌发生改变，从闭合状小球变为塌陷或开口状，且CS基体产生微孔。
(2) 通过对复合气凝胶红外光谱分析，结果表明GTA与CS和Kaf发生交联反应，并证明了Mel的成功负载。
(3) 通过耐水性能、力学性能测试表明Kaf的引入成功提升了复合气凝胶的压缩模量：从CS-M1的0.101 MPa增加至4C1K-M1的0.172 MPa；降低了吸水率和溶失率。大幅度提升了复合气凝胶的稳定性。
(4) 在Kaf含量不断增大的过程中，包封率和负载率先增大后减小。在CS/Kaf为6:1时，体系内Mel达到饱和状态。6C1K-M1样品对Mel的包封率达到48.8%负载率达到3.1%。在体系中不加入Kaf的情况下，CS-M1在12 d后的释放量是78.12%，而在添加Kaf情况下，Mel的释放量在12 d时达到61%。成功证明了复合气凝胶对Mel的缓释作用。