1. 引言
氯乙基亚硝基脲(CENUs)是一类重要的抗癌烷化剂，是目前临床上治疗恶性肿瘤的化疗药物之一。CENUs通过导致DNA生成股间交联(dG-dC交联)，阻断肿瘤细胞DNA的正常复制，诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗癌作用 [1] 。然而，由于细胞内的O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)可对CENUs导致的烷化损伤进行修复 [2] ，抑制dG-dC交联的形成，导致肿瘤细胞对药物产生耐药性。因此，抑制肿瘤细胞内AGT的活性对提高药物化疗效果具有重要意义。目前，已有一系列AGT抑制剂被合成用于与CENUs等烷化剂的联合化疗 [3] ，其中，O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)是第一个进入临床试验的AGT抑制剂，具有良好的AGT抑制活性 [4] 。O6-BG虽然为CENUs的肿瘤化疗开辟了新的领域，但临床研究表明，O6-BG由于不具有靶向性，在提高肿瘤细胞对CENUs敏感性的同时，也抑制了正常细胞内AGT的活性，进而导致了CENUs的骨髓抑制作用显著增强，降低了该类药物的化疗效应 [5] 。因此，开发具有靶向性的AGT抑制剂对于提高烷化剂类化疗药物的抗癌效果具有重要意义。
肿瘤细胞的快速增殖导致高氧消耗，肿瘤脉管系统的结构功能异常导致供氧不足，使得瘤内低氧是实体瘤的重要特征之一。因此，设计合成具有生物还原性的前体药物，使其依赖于肿瘤低氧的微环境，在低氧条件下激活为细胞毒素并靶向作用于肿瘤细胞，已成为提高化疗药物疗效的新思路。研究表明，生物还原性前体药物的激活主要通过单/双电子还原反应来实现。巴诺蒽醌在低氧细胞内通过细胞色素P450催化的两步电子还原反应最终转变为具有细胞毒性的DNA结合剂，可特异性地抑制DNA拓扑异构酶II [6] [7] 。替拉扎明在低氧条件下通过P450还原，生成高活性的自由基，诱导DNA单/双链断裂 [8] [9] 。TH-302在低氧条件下可被激活生成DNA烷化剂溴代异磷酰胺，从而靶向性地杀死肿瘤细胞 [10] [11] 。Sartorelli课题组 [12] [13] 设计合成了一类低氧激活的AGT抑制剂前体药物——4-硝基苯甲氧基羰-2-氨基-O6-苄基鸟嘌呤基，该类化合物本身对AGT无活性或活性很低，但在低氧区域即可被此区域中的还原酶激活，释放具有活性的AGT抑制剂。然而，有关低氧激活AGT抑制剂的作用机制尚未见文献报道。因此，本研究采用DFT方法对硝基苄基鸟嘌呤类化合物(NBGs)低氧激活的反应机理进行了研究，阐明了在低氧条件下NBGs经过硝基还原酶(NTR) [14] 和辅酶FMNH [15] [16] 介导的单电子传递过程和还原反应机理，为低氧激活靶向性抗肿瘤药物的开发提供了可靠的理论依据。
2. 模型及计算方法
首先，以硝基苯为模型，研究了其在低氧条件下由FMNH催化的还原反应(如图1所示)进行了研究。在此基础上，对图2所示的O6-4-硝基苄基鸟嘌呤(O6-4-NBG)在FMNH作用下分别被还原为具有AGT抑制活性的O6-4-氨基苄基鸟嘌呤(O6-4-ABG)的作用机理进行了研究。计算采用DFT方法在UB3LYP/6-31+ G(d,p)水平上进行，对所有反应物、过渡态、中间体和产物进行全几何结构优化。在相同水平上对优化得到的各驻点几何结构进行振动频率计算，确认所有稳定点无虚频；所有过渡态只含有一个虚频，并且频率的振动模式为沿着反应坐标方向的伸缩振动。计算内禀反应坐标以确认所有过渡态结构的合理性，并获得反应的最低能量途径。所有计算均采用Gaussian09程序包进行。
3. 结果与讨论
3.1. 硝基苯还原机制
如图1所示，硝基苯在FMNH的作用下被还原为苯胺的反应总共需要六个电子和六个质子的过程，它可以分解为三个步骤，这意味着存在两个中间体。在第一步还原反应中，硝基基团通过2e−/2H+的转移还原成中间体I(亚硝基)，同时消去一分子水。在第二步还原反应中，亚硝基通过2e−/2H+的转移过程转化为中间体II(羟胺)。最后，羟胺通过2e−/2H+的转移过程转化为苯胺，同时消去一分子水 [17] [18] 。为了节约计算成本，对计算模型进行了简化，将FMNH分子中的异咯嗪环上的磷酸尾链用甲基代替(即简化为
Figure 1. The pathways for FMNH reduction of nitrobenzene
图1. FMNH催化硝基苯还原的反应机理
Figure 2. The pathways for FMNH reduction of O6-4-NBG
图2. FMNH还原O6-4-硝基苄基鸟嘌呤的反应路径
FMNH-CH3)，并将使用未简化和简化后的模型计算得到能量进行了比较，以确认简化模型的合理性。以FMNH-CH3为模型采用GaussView 5.0计算得到的各步骤的过渡态结构如图3所示。在六个反应过渡态中FMNH的N5位上的N-H键与初始键长(1.01 Å)相对增长，表明FMNH的N5位上的氢有断键趋势。其余各键中氧氢键的距离减小，氮氧键增长及新的氮氢键的形成，且各反应过渡态都存在唯一虚频。
在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上以RC(0.00)为势能曲线基准采用吉布斯自由能绘制的势能曲线如图4所示。在整个反应过程中，只有第一步羟基化反应生成IC1的步骤为吸热反应，其它五个步骤均为放热反应。其中TS2反应所需跨越的能垒最高(30.11 kcal/mol)，因此经第二步脱水反应生成亚硝基苯的反应为控速步骤，并且反应放热达31.56 kcal/mol。TS3反应所需过渡态能量最低，亚硝基比硝基基团更容易发生反应，因此亚硝基苯的含量很少。TS5反应所需过渡态能量次于TS2，TS5可能是羟胺还原这一步反应的控速步骤，由于TS5反应较慢，因此羟胺被大量聚集，而TS6反应所需能量较低且前一步反应提供大量的热量，反应生成苯胺的速率较快。因此整个反应主要以羟胺和苯胺形式存在，这与实验结果相一致 [18] 。可以看出简化模型并没有改变反应势能曲线的趋势，总体能量低于未简化下的1~3 kcal/mol，因此使用简化模型对整个反应的势能曲线能量变化趋势和过渡态搜索没有太大的影响。
此外，考虑了溶剂效应对反应的影响，研究了水分子参与反应的过程，其势能曲线如图4所示。水参与的质子电子耦合转移 [19] [20] 结果表明，在水作为质子传递通道的条件下，TS2 (23.11 kcal/mol)和TS6 (13.84 kcal/mol)反应活化能被降低，比FMNH-CH3反应模型下的能量分别降低了6.4 kcal/mol和2.03 kcal/mol，因此这两步水分子参与反应降低了反应的活化能为该步反应的优势途径。采用GaussView 5.0计算得到水参与质子转移的过渡态结构和结构参数及过渡态下的HOMO轨道如图5所示。结果表明，在TS2-H2O中，质子从FMNH的N5位转移到水的一个氧原子上(N…H…O)，然后通过水转移质子到羟基化的氧上(O…H…O)，并脱去两个水分子为质子转移通道。在TS2-HOMO中，FMNH的N5的离域与硝基苯的N的离域两原子轨道重叠(N5…N)，因此在FMNH的N5位和硝基苯的N之间作为电子传递途径 [21] 。在TS6-H2O中，质子从FMNH的N5位转移到水的一个氧原子上(N…H…O)，然后通过水转移质子到IC5的N原子上(O…H…N)，并脱去一个水分子为质子转移通道。在TS6-HOMO中，FMNH的N5的离域与中间体IC5的N的离域两原子轨道重叠(N5…N)，因此在FMNH的N5位和IC5的N之间作为电子传递途
Figure 3. Optimized structures of the transition states in the reduction of nitrobenzene catalysed by FMNH calculated at the B3LYP/6-31+G(d,p) theoretical level
图3. 在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上优化得到FMNH催化硝基苯还原反应的过渡态结构
Figure 4. Energy profile for the reduction of nitrobenzene catalysed by FMNH calculated at the B3LYP/6-31+G(d,p) theoretical level
图4. B3LYP/6-31+G(d,p)水平上计算得到的FMNH催化硝基苯还原反应的势能曲线
Figure 5. Geometric structures and HOMO of the transition states in the TS2 and TS6 of nitrobenzene mediated by a water molecule
图5. 水分子参与下硝基苯的过渡态TS2和TS6的几何结构及HOMO示意图
径，形成质子电子耦合转移。Wilkie等人的研究表明 [22] ，在生成亚硝基的两步过渡态反应中至少有一步质子是来源于FMNH，而另一个质子来源于溶剂(水)，这与本实验中反应过渡态TS1得质子是由FMNH提供，TS2是由溶剂水提供结果相一致。
3.2. O6-4-硝基苄基鸟嘌呤前体药物的还原机制
对图2所示反应途径中的各驻点在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上进行全几何结构优化和过渡态的搜索，同时得出TS2和TS6在水参与下的质子耦合电子转移的最优反应路径，其GaussView 5.0计算得到各反应的过渡态结构及结构参数如图6；计算结果表明，O6-4-硝基苄基鸟嘌呤(O6-4-NBG)在FMNH的条件下被还原成O6-4-氨基苄基鸟嘌呤(O6-4-ABG)的反应分六个步骤。在各反应中FMNH的N5位上的N-H键与初始键长(1.01 Å)相对增长，其余各键中氧氢键的距离减小，氮氧键增长及新的氮氢键的形成，且各反应过渡态都存在唯一虚频。
在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上以RC(0.00)为势能曲线基准的采用吉布斯自由能绘制的势能曲线如图7。其在采用B3LYP方法计算所得的结构下各过渡态反应能垒依次为：18.97、30.14、9.45、15.68、24.81、16.91 kcal/mol。O6-4-NBG的反应趋势和反应的活化能与硝基苯势能曲线一致，可以看出硝基类化合物的
Figure 6. Optimized structures of the transition states in the reduction of O6-4-NBG catalysed by FMNH calculated at the B3LYP/6-31+G(d,p) theoretical level
图6. 在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上优化得到FMNH催化O6-4-NBG还原反应的过渡态结构
Figure 7. Energy profile for the reduction of O6-4-NBG catalysed by FMNH calculated at the B3LYP/6-31+G(d,p) theoretical level
图7. B3LYP/6-31+G(d,p)水平上计算得到的FMNH催化O6-4-NBG还原反应的势能曲线
反应机理与硝基所连的基团并没有太大影响。整个反应存在两个控速步骤分别生成亚硝基的过渡态TS2和生成氨基的过渡态TS5，整个反应主要以羟胺化合物、苯胺化合物的形式存在，亚硝基化合物被瞬间反应含量很少。其中水分子参与过渡态反应优化了反应能垒的TS2和TS6反应所需能量为29.75 kcal/mol和14.13 kcal/mol，分别降低了0.39 kcal/mol和2.78 kcal/mol，因此这两步水分子参与反应降低了反应的活化能为该步反应的优势途径。采用GaussView 5.0计算得到水参与质子转移的过渡态结构和结构参数及过渡态下的HOMO轨道示意图如图8所示。其结果表明，在TS2-H2O中，质子从FMNH的N5位转移
Figure 8. Geometric structures and HOMO of the transition states in the TS2 and TS6 of O6-4-NBG mediated by a water molecule
图8. 水分子参与下O6-4-NBG的过渡态TS2和TS6的几何结构及HOMO示意图
到水的一个氧原子上(N…H…O)，然后通过水转移质子到羟基化的氧上(O…H…O)，并脱去两个水分子为质子转移通道。在TS2-HOMO中，FMNH的N5的离域与硝基苯的N的离域两原子轨道重叠(N5…N)，因此在FMNH的N5位和硝基苯的N之间作为电子传递途径。在TS6-H2O中，质子从FMNH的N5位转移到水的一个氧原子上(N…H…O)，然后通过水转移质子到IC5的N原子上(O…H…N)，并脱去一个水分子为质子转移通道。在TS6-HOMO中，FMNH的N5的离域与中间体IC5的N的离域两原子轨道重叠(N5…N)，因此在FMNH的N5位和IC5的N之间作为电子传递途径，形成质子电子耦合转移。过渡态TS2和TS6降低了过渡态反应的活化能分别为这两步反应的优势路径。
4. 结论
综上所述，在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上进行全几何结构优化和过渡态的搜索的计算结果表明，硝基类化合物能够在低氧条件下被FMNH催化还原生成氨基类化合物。在整个还原反应中过渡态TS2和过渡态TS5分别为生成亚硝基和生成苯胺的两个反应的控速步骤。由于水分子在生物体内大量存在，考虑水分子对整个反应的影响，得出由水介导的过渡态TS2和TS6为这两步催化还原反应的优势途径。综上所述，通过密度泛函的方法，阐明了在低氧条件下NBGs经过硝基还原酶和辅酶FMNH介导的单电子传递过程和还原反应机理，为低氧激活靶向性抗肿瘤药物的开发提供了可靠的理论依据。